corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia aula 6a ore corso di genomica a.a. 2009/10 lezione venerdì 18 Dicembre 2009 esami: 1 febbraio 25 febbraio

Mouse Igh cluster Chromosome 12 Human Igh cluster Chromosome 14 12F1 14q32.33 mta1 JDVJDV JDVJDV crip2crip1hole mta1crip2crip1hole a b JDV JDV elk 2.1 hs4hs1.2hs320bp hole elk 2.2 hs4hs1.2hs3 20bp hs 4hs 3B hs 1,2hs 3A hs 4 hs 1,2hs 3 hs 4 hs 1,2hs BAC199M11(AF450245) 86,035,00086,040,00086,045,00086,050,00086,055,00086,065,00086,070,00086,075,00086,060,000 85,894,50085,904,50085,914,50085,924,50085,934,50085,944,50085,954,500 centromerotelomero trascrizione IgH3RR-1 IgH3RR-2 (cloni instabili) cluster Ig topo-uomo (duplicazione) TOR VERGATA

se nelluomo ci sono due 3RR ci sarà un motivo ? 3 domande + 1: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ? nelluomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male) - dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3RR ? - hanno tempi di attivazione diversi? perchè due 3RR ? sono ridondanti ? - si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B? TOR VERGATA U

Chromosome 14 IgH3RR-2 SF AL ( 40 kb) H 2 B HS3 B U2U2 U4U4 U5 B R3 H HS1,2 E R3r U5r U1 R1 U3U3 U6 U7U7 U 8r B U6r HS4 Ub1 U 4-5 R3 U7r Ub2 B H R4 U9U9 R5 Ub3 U 10 R5 U1 1 U 12 R6 SA2.5 A2RA2F Alu U15U16 H LTR END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 U14U13 Ub4 H 1 B HS3 B U2 U4 U5 B R3 H*H* HS1,2 E R3rU5r U1R1 Ua1 R2 U3 U6U7U8 B U6r HS4 BH Ua2 R4 Ua3 U9 Ua4 R5 U10 U11 R5 U12 R6 U13 SA2.5 A2R Alu U15 U16 H LTR END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 K10 retrovirus ELK2 H U 14 Ua5 A B centromero clone CHR77 ( kb) Poly A site Poly A site IgH3RR-1 TOR VERGATA

solo HS1.2 è polimorfica gli enhancer HS3 ed HS4 non sono polimorfici HS1.2 è centrale e sta allinterno di una duplicazione non si conosce molto delle funzioni al di là delle regioni conservate contenenti gli enhancers le regioni intermedie sono poco conservate nelle specie anche allinterno dei mammiferi è possibile studiare le assoociazioni nelluomo tra polimorfismi, funzioni e patologie

se regola la risposta immunitaria sul topo molti lavori indicano i meccanismi in cui la 3RR si inserisce: BCR expression, Ig germline transcription, class switch, B cell maturation (molec e cell biol, topi transgenici) nelluomo lavori di biologia cellulare-molecolare confermano il ruolo importante delle 3RR, ma sono due invece di una possibili differenze sulluomo si studiano i polimorfismi non possibili su topo cosa sono i polimorfismi di HS1.2

Internal spacers Conserved sequence Unit Selective amplification of HS1,2-B downstream C 2 (IgH3RR-2) H 2m HS 3 B B H HS 1,2 EB SA2.5 A2R A2F HS1, bp ALLELE 3B ALLELE 4B Poly A site H 1m B HS 3 BB H*H* B 5402 bp SA2.5 A2R HS1,2 HS 3 Selective amplification of HS1,2-A downstream C 1 (IgH3RR-1) ALLELE 1A HS1,2 P3Frw D3Rev EcoRI ALLELE 2A ALLELE 3A ALLELE 4A HS 1,2 AB B E Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp Repeated element - 38 bp External element -17 bp EcoRI Ua1 R1R2 U1 U5 U4 U2 U3 R3 rR3 U6U7 U8 U1R1 U2 Ub1 UU 3 4 U5 U6 R3 U8 r U4-5 U7r R3r U6r U5r Ub2 R4 14bp16bp20bp P3Frw HS1,2 D3Rev EcoRI i polimorfismi TOR VERGATA

6 alleli Figure 3 polymorphism of HS1,2A Sites for : SP1; IK2; MZF1 Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-) Sites for : AP4; E47; MYOD; E5 Sites for : NF-kB Sites for : CMYB ALLELE *4 20bp Sp. 17bp El.END HS1,2 CORE enhancer 17bp El.38bp Rp 14bp Sp. ALLELE *1A 287 ALLELE *2A bp Sp. ALLELE *2B 360 ALLELE *3A 31bp El bp El20bp Sp. 14bp Sp ALLELE *3B 31bp El bp Sp 17bp El 20bp Sp TOR VERGATA

Immunology 2001, 103: Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3 enhancer HS1,2 and its relation to gene expression TOR VERGATA U

M2M1 ALLELE 1 ALLELE 4 ALLELE 3 ALLELE 2 GRR-1RR-2GRR-1RR-2 CM11CM 4CM 5 GRR-1RR bp 400 bp 200 bp 300 bp gel genomico e selettivo degli alleli amplificazione G=genomica o selettiva RR-1; RR-2 nellamplificazione genomica si vedono gli alleli delle 2 regioni senza PCR selettiva applicata invece per amplificare selettivamente A o B. TOR VERGATA U

i due alleli *2a, *2b e *3a, *3B avevamo visto che nel locus 3RR-B lallele *3 aveva lelemento 31mer rispetto al 17mer del locus 3RR-A adesso abbiamo (ho) visto che anche lallele *2 esiste nelle due forme con il 17mer ed il 31mer, cambiano le consensus! allele *4 allele *3 allele *2a allele *2b allele *1 465 bp 393 bp 360 bp 339 bp 287 bp amplificazioni da DNA genomico dalle due 3RR senza selezione

Evoluzione di HS1,2 in diverse specie di mammifero e di primati il core dellenhancer è più conservata (rosa) ed il 31mer (arancio) potrebbe essere la forma ancestrale stiamo cercando di clonare le forme polimorfiche di altre specie (topo macaco, scimpanzè) per confrontare la funzionalità in cellule di topo e uomo allineamenti TOR VERGATA U

conservazione in altre specie Homo s.; Gorilla; Orango; Homo s. allele 4; Cavia; Macaca; Callitrix; Canis; Equus; Felis; Pteropus; Rattus; Mus; Bos; Sus; Callicebus; Monodelphis (opossum);Capra; Gallus.

platirrine - catarrine 40 Mya

evoluzione della IgH 3RR

strutture conservate di HS1.2 manca la sequenza di Panda uscita il 13 Dicembre 2009

quali altre analisi ? il polimorfismo si può studiare dal punto di vista funzionale struttura e modelli in silicio (transcr. fact.; 3D models) CHIP chromosome immuno-precipitation EMSA electrophoretic mobility shift assay: -incubazione della sonda con le consensus con estratti nucleari -corsa elettroforetica -competizione con anticorpi o con consensus che sottraggono la formazione del complesso e fanno sparire il segnale

mappatura tramite competizione con gel shift EMSA Probe (allele *2A) NE (Fleb cells) Competitor Probe (allele*2A) Competitor (alele*1A) Competitor (* 2A - fragment 1) Competitor (* 2A - fragment 2) Competitor (* 2A - fragment 3) SP1 compete banda B NF-kB banda C Allele *1A a b c d Oct *2A frg 1 *2A-frg2 *2A-frg3 NF- B ** frgm 1 allele *1A comp B (+D) frgm 2 comp C (+D) NF-kB frgm 3 B (-D) * * * * * * * * * * * *

electrophoresis mobility shift assay with allele *1 and *2 DNA binding experiment with nuclear proteic extracts Allele *2 Allele *1 Fragm 2 Fragm 1 Fragm 3 competitors Fragm Fragm Fragm 1 Fragm Fragm Fragm 18 Mutated PROBE NE (Fleb Cells) Competitor a c b a 18mer mut 18mer Allele *2 Fragm 1 Fragm 2 Fragm 3 NF-kB Sp1 Oct1 Fragm 1 Allele *1 Fragm 1 Fragm 2 Fragm 3 NF-kB Oct1 NF-kB consensus Oct 1 consensus anti Sp1 antiboby Probe (allele*2) Probe (alele*1) Probe (allele*2) ABCD EMSA

Consensus for Sp1 and NF-kB in HS1,2-A allele*1 and *2

SNPs haplotype map

le frequenze degli aplotipi le frequenze degli aplotipi più frequenti per lallele *1 sono uguali nel contrl. e nella Psoriasi P = 0.65 per lallele *2 sono diverse nei contrl e nella psoriasi P = campione piccolo n.30

frequenze alleliche ed epidemiologia un regolatore delle Ig polimorfico che frequenze ha nelle popolazioni AfricaAsiaAmerAustrEurope TOR VERGATA U

frequenze in 11 località italiane

I livelli delle Ig nel plasma (%)

alterazione delle Ig

alterazione e frequenze alleliche

difetto di IgA V.Giambra et al. J.Imm. vol 183 n.12; 15 Dic.2009

livelli di Ig nel difetto di IgA

come stanno i CD19 χ 2 = 7,090; P value = 0,0289; OR = 3,604 TABLE III. HS1.2 frequencies in IgAD patients with low or high levels of CD19 + cells, normal range 15-25% troppo pochi

se il polimorfismo condiziona nella macchina interattiva del linfocita B quale può essere il ruolo del polimorfismo di HS1,2 per ora sappiamo che interagisce in modo diverso con i complessi di SP1 ed NF-kB nella risposta immunitaria e nelle patologie immunologiche svolge un ruolo che condiziona le normali funzioni ma ci possono essere altri polimorfismi associati la 3RR sta ad un incrocio della regolazione non più soltanto del linfocita B

CLL chronic B-lymphocytic leukemia

nella risposta immune esiste una diversa risposta a seconda delle freq. alleliche * * Swaziland ** ** Roma *** *** Bengasi

cosa succede nelle patologie ? come combiano le frequenze alleliche di HS1,2 (* Roma) *

SNPs haplotype map