PHOTON-TIMING DETECTOR MODULE FOR SINGLE-MOLECULE SPECTROSCOPY POLITECNICO DI MILANO PHOTON-TIMING DETECTOR MODULE FOR SINGLE-MOLECULE SPECTROSCOPY I.Rech*, M. Ghioni*, S. Cova*, H. Yang°, G. Luo°, X.S. Xie° * Dip. di Elettronica e Informazione and IFN-CNR, POLITECNICO DI MILANO ° Dep. of Chemistry and Chemical Biology, HARVARD UNIVERSITY Buon giorno, mi chiamo Ivan Rech e questo è il titolo della presentzione

Sommario : Introduzione : perché misure su singole molecole Misure di fluorescenza “time-resolved” Single Photon Avalanche Diode (SPAD) Modulo SPTM2 Risultati sperimentali Vedremo innanzi tutto perché c’e’ un così forte interesse verso le misure su singole molecole. Mostrerò l’idea alla base del sistema ideato dal Prof. Sunney Xie e come i nostri rivelatori siano gli unici che gli hanno permesso di realizzarlo Vedremo dunque il modulo SPTM2 ed i risultati con esso ottenuti.

Perché misure su singole molecole? Misure di proprietà di molecole NON MEDIATE SU INSIEME Possibilità di seguire in tempo reale l’evoluzione Informazioni sulla dinamica della molecola Molecole di interesse biologico : Proteine FRET : Fluorescence Resonance Energy Trasnfer Perché dunque fare misure su singole molecole? Grazie a questo tipo di analisi i chimici estrarre informazioni relative alla SINGOLA molecola, a differenza di quanto fatto nelle comuni misure in cui i dati sono frutto della media di moltissime molecole in configurazioni differenti. Secondo, e molto importante per i biochimici, possiamo seguire IN TEMPO REALE i processi biochimici analizzando i stati intermedi dell’evoluzione Terzo, con questo tipo di analisi possiamo ottenere informazioni sulla dinamica della singola molecola. Le molecole in considerazioni sono macro molecole di interesse biologico, quali ad esempio le proteine, di cui occorre misurare piccolissime variazioni di configurazione. Una delle tecniche più impiegate è la FRET, grazie alla quale, è possibili ricavare variazioni di struttura nanometriche. Variazioni di struttura nanometriche

Single Molecule Structural Dynamics Non ho le competenze per addentrarmi nei dettagli tecnici di questo tipo di esperimenti… in quest’immagine è possibile vedere una rappresentazione pittorica realizzata da un collega di Harvard che mostra come una minima variazione del parametro R, ovvero la distanza tra queste due parti di molecola…si traduca in una variazione misurabile del tempo di vita medio della sua fluorescenza…. ecco quindi che il tempo di decadimento rappresenta il nostro “righello”con cui misurare le configurazioni molecolari. Come dicevo,la FRET ollfre risoluzioni nanometriche, mentre, in questo tipo di analisi c’e’ un forte interesse a scendere su scale subnanometriche in quanto piccoli spostamenti possono portare ad enormi cambiamenti configurazionali.

Nuovo metodo di X.S. Xie, Harvard University - Basato su eccitazione con impulsi laser - Rivelazione fotoni fluorescenti e misure di: Ritardo emissione risp. eccitazione Tempo reale di emissione Analisi per correlazione Excitation pulse train Il prof Sunney Xie ha quindi ideato un nuovo metodo di misura basato sull’eccitazione della fluorescenza mediante impulsi laser, la rivelazione dei fotoni fluorescenti di cui viene misurato Il ritardo di emissione rispetto all’eccitazione E soprattutto l’istante assoluto in cui questo viene rivelato…informazioni che nelle comuni analisi per time correlated photon couting viene perso all’interno dell’istogramma generato. Tramiti un’analisi per correlazione non banale è quindi possibile estrarre da questi dati informazioni sulla configureazione della singola molecola con risoluzione subnanometrica e con una statitica migliore di quella delle comuni analisi in quanto non viene persa l’informazione relativa al tempo asoluto. t1 t2 t3 photon

Setup di Misura ? Questo è lo schema del sistema utilizzato da Xie per le sue miure: Un laser Ti:Zaffiro genera il treno di impulsi di eccitazione a 76 MHz che dopo esser stato duplicato viene guidato verso un microscopio rovesciato Zeiss che lo focalizzerà sul campione da misurare, da qui, grazie ad un sistema ottico a più lenti il segnale filtrato viene focalizzato sul rivelatore. Già, il rivelatore. Che tipo di rivelatore è necessario per questo tipo di analisi?

Requisiti del Rivelatore Alta QE (Quantum detection Efficiency) > 40% Basso rumore intrinseco < 50c/s Alta Risoluzione Temporale (FWHM) < 100ps NON ESISTONO RIVELATORI COMMERCIALI CON QUESTE CARATTERISTICHE Cerchiamo di capire quali siano i requisiti richiesti al sistema di rivelazione: Vogliamo un’alta qe, >40%, essendo il segnale molto debole, Per lo stesso motivo non vogliamo essere limitati dal rumore del dispositivo, volgiamo dunque una dark counts inferiore ai 50 conteggi al secondo. Infine, volgiamo misurare tempi di decadimento nell’ordine di poche centinaia di picosecondi… è dunque FONDAMENTALE una risoluzione temporale inferiore ai 100ps. OGGI IN COMMERCIO NON ESISTONO RIVELATORI CON QUESTE CARATTERISTICHE.

Single Photon Avalanche Diode (SPAD) I rivelatori che si candidano ad essere utilizzati in queste alalisi sono i Single Photon Avalanche Diode

PerkinElmer SPCM (SLIKTM diode) QE: 30% (@500nm) OK Dark Counts: 150 c/s OK FWHM: >300ps NO! High voltage : 300 to 400V High dissipation Delicate and degradable Very expensive Reach-Trough structure Typical active region: 200 m diameter Tra questi, nella analisi FRET vengono impiegati i moduli SPCM Perkin Elmer, come vediamo a 500nm (lunghezza d’onda della fluorescenza) l’efficienza quantica è buona, così come, per i moduli selezionati, anche il dark counts che puo’ scendere attorno ai 100c/s. Ciò che manca è la risoluzione temporale: Anche nei moduli selezionati però la FWHM rimane superiore ai 250-300ps rendendo così di fatto impossibile utilizzarli per il metodo ideato da Xie. Dal punto di vista ingegneristico i moduli SPCM presentano inoltre svantaggi quali l’alta tesnsione, l’alta dissipazione….nonché un prezzo elevato…associato ad un estrema delicatezza.

Sviluppo SPAD (Polimi e IMM-CNR) Good QE and low noise Picosecond timing Low voltage : 15 to 40V Low power : cooling not necessary Standard Si substrate Planar fabrication process COMPATIBLE with array detector and integrated circuits Robust and rugged Low-cost Planar structure typical active region: 20-50 m diameter Qui vediamo riportata la cross section dei nostri dispositvi. La struttura è ormai nota. Si basano su una tecnologia planare e sono caratterizzati da una bassa tensione di lavoro ed una bassa potenza dissipata, Sono compatibili con la realizzazione di array la realizzazione di sistemi monolitici con elettronica integrata….

Quantum Efficiency e Dark Counting Rate Come dicevamo i requisiti richiesti per questo tipo di analisi erano: L’alta efficienza quantica… che come si puo’ notare è , alla lunghezza d’onda di interesse, attorno al 30% così come abbiamo visto per il Perkin elmer. Qui vediamo invece l’andamento dei conteggi di buio in funzione della temperatura, a temperature facilmente raggiungibili con una cella peltier come si vede è possibile scendere addirittura a QUALCHE conteggio al secondo!

Modulo SPTM2 Vediamo quindi il modulo realizzato attorno a questo rivelatore

Modulo SPTM2 Compatto (82x60x30mm) Sfruttare le Performance Singola alimentazione Tensioni programmabili Hold off programmabile Interfaccia RS-232 Controllo di Temperatura Pulse Counter integrato Sfruttare le Performance del Rivelatore Sistema Compatto e User Friendly Volevamo sfruttare tutte le potenzialaità del rivelatore E al tempo stesso era necessario un modulo compatto e semplice che potesse adattarsi bene al sistema di misura. Troviamo qui elencate le principali caratteristiche del modulo realizzato: Oltre ad essere molto compatto ed avere una singola alimentazione, grazie ad un interfaccia RS 232 è possibile programmare la tensione di polarizzazione del rivelatore ed il suo tempo morto. Cuore di questo modulo è pero il circuito di spegnimento attivo. La stessa interfaccia è infine usata per la gestione del controllo di temperatura e l’acquisizione dei dati

Single-Photon Avalanche Diode APD SPAD Avalanche PhotoDiode APD Linear-mode: AMPLIFICATORE Single-Photon Avalanche Diode SPAD Vorrei infatti ricordare brevemente che gli SPAD, a differenza degli APD vengono polarizzati SOPRA la tensione di breakdown e per questo sono dispositivi a TRIGGER che necessitanto di un’elettronica dedicata. Geiger-mode: TRIGGER device!!

iAQC: integrated Active Quenching Circuit Tempo morto corto e ben definito High counting rate > 1 Mc/s Impulso Standard d’uscita iAQC, oltre la miniaturizzazione… Capacità ridotte Carica di valanga ridotta Afterpulsing ridotto Come è noto, i circuiti di spegnimento attivo garantiscono vantaggi quali: Un tempo morto corto e soprattutto ben definito La possibilità di ariivare ad alti conteggi Ed un impulso standard d’uscita Noi abbiamo realizzato e brevettato i primi circuiti di spegnimento totalmente integrati che, oltre alle caratteristiche sopra descritte aggiungono: Capacità parassite ridotte che portano ad una diminuzione della carica di valanga e quindi dell’fterpulsing Oltre alla evidente possibilità di miniaturizzazione. F.Zappa, S.Cova, M.Ghioni, US patent

Modulo SPTM2: Diagramma a Blocchi Ecco dunque lo schema a blocchi del sistema realizzato, diviso nelle sue parti fondamentali, Controllo di temperatura, E scheda principale sulla quale trovano spazio gli elementi principali di questo modulo. Grazie ad un’attenta progettazione proprio di questa parte è stato possibile raggiungere le prestazioni temporali richieste.

Risoluzione Temporale PerkinElmer SPCM (SLIKTM diode) Planar thin Si-SPAD Ecco dunque il confronto tra la risoluzione temporale di uno dei nostri rivelatori e quella di un modulo SPCM selezionato. Lo SPAD progettato garantisce quindi NON SOLO l’alta efficienza quantica ed i bassi conteggi…. MA ANCHE un’elevata risoluzione temporale.

Risoluzione Temporale @500nm La differenza tra le prestazioni temporali diventa ancora più evidente alla lunghezza d’onda tipica della fluorescenza in cui nel nostro dispositivo è evidente la riduzione della coda dovuta alla diffusione.

Modulo SPTM2 Ecco dunque il modulo SPTM nella sua visione d’insieme e dall’alto in cui è possibile intravvedere il rivelatore montato sulla cella peltier.

Risultati Sperimentali Grazie alle performance appena descritte è stato possibile utilizzare il modulo per realizzare l’idea di Sunney Xie.

Misure su Singola Molecola Queste sono le misure effettuate… sulla destra è mostrata una scansione del vetrino in cui le macchie chiare rappresentano le singole molecole Posizionandosi quindi su una di queste è stato possibile estrarre la risposta temporale. Grazie alla risoluzione del temporale dell’SPTM è stato possibile identificare costanti di tempo non rilevabili con i sistemi precedentemente utilizzati….

IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, in press, 2004 “Single-Molecule Protein Dynamics on Multiple Time Scales Probed by Electron Transfer” Haw Yang*, Guobin Luo*, Pallop Karnchanaphanurach*, Tai-Man Louie‡, Ivan Rech°, Sergio Cova°, Luying Xun‡ and X. Sunney Xie* * Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, Cambridge, MA 02138. ‡ School of Molecular Biosciences, Washington State University, Pullman, WA 99164. ° Dipartimento di Elettronica e Informazione, Politecnico di Milano Science, Vol.302, 262-266, 10 Oct. 2003. “Photon-Timing Detector Module for Single-Molecule Spectroscopy with 60ps Resolution” Ivan Rech, Guobin Luo*, Masimo Ghioni, Sergio Cova, Haw Yang*, X. Sunney Xie* Dipartimento di Elettronica e Informazione, Politecnico di Milano *Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, Cambridge, MA IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, in press, 2004 I risultati ottenuti sono stati oggetto di pubblicazione su SCIENCE nel 2003.