Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studio Rete Informativa su Ozono e Vegetazione Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studio delle risposte agli stress nelle piante R. Bernardi, M. Durante, L. Guidi, G. Lorenzini, C. Nali, S. Pasqualini, C. Pugliesi, A. Ranieri, A. Saviozzi, L. Sebastiani, M. Badiani Ozono e vegetazione: il contributo della ricerca italiana 24 Novembre 2006 Centro Interdipartimentale Ricerche Agro-Ambientali "Enrico Avanzi" San Piero a Grado, Pisa

La Bel-W3 e la Bel-B di tabacco

(da Lorenzini, 1999)

Perché “non solo danni”? Perché il danno visibile non è sempre correlato all’effetto biologico globale Perché danno visibile ed “effetti subliminali” (sensu Lorenzini) mostrano spesso percorsi molecolari distinti Perché l’ozono evoca risposte di difesa comuni anche ad altri fattori di stress, biotici ed abiotici

(da Buchanan, Gruissem e Jones, 2001)

(Zhang e Klessig, TIPS, 6, 520-527, 2001)

Ormoni & molecole segnale Risposte molecolari di difesa dall’ozono Fitoalessine & fenilpropanoidi Flussi di Ca Proteine PR Sistemi antiossidanti Barriere fisiche (lignina, estensine, callosio) Ormoni & molecole segnale (ET, SA, JA) Morte cellulare programmata (HR/PCD)

L’ozono come strumento preciso, riproducibile, potente ma finemente modulabile da impiegare come elicitore abiotico di risposte di difesa MIUR-PRIN 1998, 2000, 2002, 2003, 2005 UniPG S. Pasqualini & Coll. L. Guidi A. Ranieri A. Saviozzi + Coll. UniPI R. Bernardi M. Durante C. Pugliesi + Coll. SSSUP UniMRC L. Sebastiani & Coll.

UR-UniMRC, PRIN 2003 & 2005 Uso di linee di pomodoro mutanti o transgeniche per uno o più componenti coinvolti nei networks di elicitazione e difesa UniTuscia – G.P. Soressi, M. Ciaffi & Coll Materiale vegetale Supervisione bioinformatica & genetica UniPG– S. Pasqualini & Coll Ormoni (SA, JA) SSSUP – L. Sebastiani & Coll ROS (H2O2) & NOS (NO) UniMRC – M. Badiani & Coll ET, antiox, espressione genica, ROS (.O2-), morte cellulare (Evans’ Blue), HCN UniPI – G. Lorenzini & Coll Trattamenti & patologia

PRIN-MIUR 2003-2005 Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante all’ozono e ad altri stress abiotici Obbiettivi: caratterizzare le risposte allo stress da ozono e/o altri stress; seguire l’induzione di stress ossidativo extra- ed intracellulare; determinarne gli effetti specifici nei vari compartimenti cellulari; caratterizzare i trasduttori di segnali; studiare l’espressione di geni coinvolti nelle risposte ai vari livelli. Cofinanziamento totale 203.800 Euro

PRIN-MIUR 2003-2005 Pathway di trasduzione del segnale nella risposta delle piante all'ozono: ruolo dell'acido jasmonico e del processo di morte celulare programmata Meccanismi molecolari di induzione genica coinvolti nella risposta delle piante all'ozono (Bernardi-Durante-Pugliesi) Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante all’ozono e ad altri stress abiotici: aspetti fisiologici e biochimici (Guidi-Ranieri) Il ruolo dei secondi messaggeri nei meccanismi di trasduzione dello stress da ozono in specie d’interesse agrario Ruolo di H2O2, etilene e cistein-proteasi nella risposta all’ozono ed a stress da alta temperatura in pomodoro

PRIN-MIUR 2005-2007 Obbiettivi: L'ozono come strumento per lo studio dello stress biotico ed abiotico nelle piante: analogie e divergenze nelle risposte di compensazione e difesa, inducibilità crociata e protezione crociata Obbiettivi: caratterizzare e monitorare degli effetti mediati dal suolo ed interazioni pianta/suolo in presenza di stress combinato da ozono e metalli pesanti; analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da metalli pesanti; analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da elevata irradianza, elevata temperatura o sostanze chimiche; ruolo di recettori di membrana, proteina chinasi e fattori di trascrizione ed interazioni tra molecole segnale nella percezione e trasduzione dello stimolo e nell'orchestrazione di risposte di difesa in condizioni di stress da ozono e/o infezione da patogeno.

PRIN-MIUR 2005-2007 Cofinanziamento totale 142.656 Euro

PRIN-MIUR 2005-2007 La risposta delle piante allo stress da ozono e da patogeno: percezione e pathway di trasduzione del segnale Meccanismi molecolari coinvolti nell'attivazione di geni differenzialmente espressi in seguito a stress da ozono in ibridi di pioppo sensibili e tolleranti (Bernardi-Durante-Pugliesi). Ozono e metalli pesanti: analogie e differenze tra le risposte del sistema suolo-pianta ai due fattori di stress (Guidi-Ranieri-Saviozzi) Il ruolo del glutatione e del perossido di idrogeno nella risposta delle piante allo stress da ozono e metalli pesanti: sistemi di difesa antiossidativi e fitochelatine Interazioni nell'induzione di risposte di difesa all'ozono e ad agenti fisici e chimici di stress in mutanti di pomodoro per la sintesi di pigmenti fotosintetici e/o fotoprotettivi o per l'espressione di geni coinvolti nel meccanismo di PCD

Specie vegetali Specie Accessioni S. lycopersicum (pomodoro) linee differenzialmente suscettibili a virus o tracheomicosi; mutanti per la percezione/biosintesi di etilene; mutanti “lesion mimic”; mutanti per il colore; transgeni (resistenza al patogeno/ PCD) Ph. vulgaris (fagiolo) cultivar differenzialmente suscettibili H. annuum (girasole) N. tabacum (tabacco) Bel-W3/Bel-B L. albus (lupino) A. thaliana ecotipo Col-0 e linee mutanti “loss of function” P. deltoides x P. maximowiczii - P. x euramericana (pioppo) cloni differenzialmente suscettibili

Combinazione di stress Trattamenti con ozono acuto: 100 – 300 ppb per ore cronico 60 -100 ppb per giorni Combinazione di stress metalli pesanti alta irradianza ipertermia infezione da batteri o funghi fitopatogeni

Effetti & funzioni Danno visibile Fitochelatine Accrescimento Proteine correlate alla patogenesi Assorbimento ed utilizzazione dell’energia luminosa: assimilazione netta di CO2 pigmenti (fotosintetici, fotoprotettivi, antiossidanti e dissipazione dell’energia fluorescenza della clorofilla a in vivo carbossilasi primarie e ciclo di Calvin Metabolismo secondario (fenilpropanoidi, antocianine) ROS (perossido d’idrogeno, superossido, ossido nitrico) quali pro-ossidanti (burst ossidativo) o messaggeri Ormoni (ET, JA, SA) e loro metabolismo (metodi originali di dosaggio ad hoc; approccio “farmacologico”) Geni ed enzimi ROS-generanti Recettori e cascate di segnalazione (MAPK) Geni ed enzimi ROS-scavenging Espressione genica e regolazione della trascrizione (isolamento ed analisi del promotore e fattori di trascrizione) Antiossidanti e loro metabolismo Senescenza Geni della biosintesi di antiossidanti Morte cellulare/HR/PCD (differenziazione / lancio ed esecuzione / contenimento)

Attrezzature, strumentazione & tecniche Fumigazione in ambiente controllato Scambi gassosi mediante IRGA Microscopia ottica ed elettronica Microestrazione in fase solida Analisi d’immagine Cromatografia liquida ed in fase gassosa interfacciate a spettrometria di massa Analisi chimica e biochimica del suolo Enzimologia Frazionamento cellulare e purificazione di organuli Immunoquantificazione di proteine (analisi Western) Infiltrazione sottovuoto di tessuti Estrazione e purificazione di acidi nucleici Spettroscopia UV/VIS e di fluorescenza Studio espressione genica [analisi Northern, RT-PCR, cDNA-AFLP, ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH), analisi globale del trascrittoma (arraying), studio dei patterns di espressione, ibridazione “in situ” ] Spettroscopia atomica Metodologie bioinformatiche & biostatistiche (disegno di primers, esplorazione di banche dati, espressione genica comparata) Analisi della dinamica stomatica Tecniche di ibridazione e trasformazione genica

PRIN-MIUR 2003-2005 / 2005-2007 Pubblicazioni 2003-2006

Analysis of gene expression induced by chronic ozone exposure in the Mediterranean shrub Phillyrea latifolia L. by cDNA-AFLP A.R. Paolacci, C. Miraldi, O. A. Tanzarella, M. Badiani, E. Porceddu, C. Nali, G. Lorenzini and M. Ciaffi (submitted)

Progetto FIRB-PlantSTRESS Caratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento (Marabottini et al., 2005)

Progetto FIRB-PlantSTRESS Caratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento (Paolacci et al., 2004) Tab. 1 – Homologies with sequences in the databases of wheat cDNA sequences preferentially expressed in ozonated plants. Clone bp Expression Homology BLAST Species Homologous protein Function pattern (Acc. N.) score ODI-5 472 4 AL162295 155 A. thaliana Putative phosphatidate cytidyltransferase Signal transduction ODI-12 431 3 AY26514 178 L. esculentum MAP kinase Signal transduction ODI-14 485 4 U48692 285 T. aestivum Calmodulin Signal transduction ODI-22 780 4 AJ439082 431 O. sativa Phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase (PIPK1) Signal transduction ODI-37 729 4 Q8GXJ4 332 A. thaliana Glutamate-receptor Signal transduction OPI-1 597 4 AP005071 356 O. sativa Inositol-1-monophosphatase Signal transduction OPI-39 653 5 AF325197 391 T. aestivum LRR Receptor-like kinase Signal transduction ODI-7 378 6 AP004871 246 O. sativa EH an EF protein Involved in endocytosis and signal transduction ODI-4 722 3 AJ440792 447 T. aestivum Glutathione S-transferase Cell rescue-defence ODI-11 437 4 AJ579381 203 T. aestivum Glutathione synthetase Cell rescue-defence ODI-21 717 4 AJ508916 467 O. sativa Gamma-glutamyl-cysteine synthetase Cell rescue-defence OPI-14 404 5 AF532973 272 T. aestivum Chloroplastic ascorbate-peroxidase Cell rescue-defence OPI-20 392 5 AJ0066358 241 H. vulgare Cytosolic ascorbate peroxidase Cell rescue-defence OPI-21 679 4 AJ440793 456 T. aestivum Glutathione S-transferase Cell rescue-defence OPI-30 567 4 P40880 282 H. vulgare Carbonic anhydrase Cell rescue-defence ODI-38 453 4 AV196004 265 T. aestivum Allene oxide synthase Jasmonate biosynthesis ODI-40 462 4 AJ308488 210 H. vulgare Allene oxide cyclase Jasmonate biosynthesis ODI-6 662 6 AP000559 392 O. sativa ACC synthase Ethylene biosynthesis ODI-15 705 6 AP004058 354 O. sativa ACC oxidase Ethylene biosynthesis ODI-9 832 4 AJ132927 418 C. sativus Carotenoid oxidase ABA biosynthesis OPI-15 725 5 AY093583 422 O. sativa Rnase L inhibitor-like protein Transcription OPI-27 443 4 AC002062 174 A. thaliana MYB protein Transcription ODI-17 784 1 BX842607 288 O. sativa Putative subtilase Protein degradation OPI-2 597 2 AF118223 367 A. thaliana Putative ABC transporter Cellular organization ODI-1 561 4 AP005251 120 O. sativa Unknown Unknown ODI-3 764 1 AC024814 184 C. elegans Unknown Unknown OPI-9 413 2 AC107226 163 O. sativa Unknown Unknown OPI-12 720 5 AY223810 291 R. erithropolis Unknown Unknown ODI-33 642 6 AE017099 370 O. sativa Unknown Unknown Tab. 1 – Homologies with sequences in the databases of wheat cDNA sequences preferentially expressed in ozonated plants. Clone bp Expression Homology BLAST Species Homologous protein Function pattern (Acc. N.) score ODI-5 472 4 AL162295 155 A. thaliana Putative phosphatidate cytidyltransferase Signal transduction ODI-12 431 3 AY26514 178 L. esculentum MAP kinase Signal transduction ODI-14 485 4 U48692 285 T. aestivum Calmodulin Signal transduction ODI-22 780 4 AJ439082 431 O. sativa Phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase (PIPK1) Signal transduction ODI-37 729 4 Q8GXJ4 332 A. thaliana Glutamate-receptor Signal transduction OPI-1 597 4 AP005071 356 O. sativa Inositol-1-monophosphatase Signal transduction OPI-39 653 5 AF325197 391 T. aestivum LRR Receptor-like kinase Signal transduction ODI-7 378 6 AP004871 246 O. sativa EH an EF protein Involved in endocytosis and signal transduction ODI-4 722 3 AJ440792 447 T. aestivum Glutathione S-transferase Cell rescue-defence ODI-11 437 4 AJ579381 203 T. aestivum Glutathione synthetase Cell rescue-defence ODI-21 717 4 AJ508916 467 O. sativa Gamma-glutamyl-cysteine synthetase Cell rescue-defence OPI-14 404 5 AF532973 272 T. aestivum Chloroplastic ascorbate-peroxidase Cell rescue-defence OPI-20 392 5 AJ0066358 241 H. vulgare Cytosolic ascorbate peroxidase Cell rescue-defence OPI-21 679 4 AJ440793 456 T. aestivum Glutathione S-transferase Cell rescue-defence OPI-30 567 4 P40880 282 H. vulgare Carbonic anhydrase Cell rescue-defence ODI-38 453 4 AV196004 265 T. aestivum Allene oxide synthase Jasmonate biosynthesis ODI-40 462 4 AJ308488 210 H. vulgare Allene oxide cyclase Jasmonate biosynthesis ODI-6 662 6 AP000559 392 O. sativa ACC synthase Ethylene biosynthesis ODI-15 705 6 AP004058 354 O. sativa ACC oxidase Ethylene biosynthesis ODI-9 832 4 AJ132927 418 C. sativus Carotenoid oxidase ABA biosynthesis OPI-15 725 5 AY093583 422 O. sativa Rnase L inhibitor-like protein Transcription OPI-27 443 4 AC002062 174 A. thaliana MYB protein Transcription ODI-17 784 1 BX842607 288 O. sativa Putative subtilase Protein degradation OPI-2 597 2 AF118223 367 A. thaliana Putative ABC transporter Cellular organization ODI-1 561 4 AP005251 120 O. sativa Unknown Unknown ODI-3 764 1 AC024814 184 C. elegans Unknown Unknown OPI-9 413 2 AC107226 163 O. sativa Unknown Unknown OPI-12 720 5 AY223810 291 R. erithropolis Unknown Unknown ODI-33 642 6 AE017099 370 O. sativa Unknown Unknown