Sottolineare i diversi elementi chimici presenti nei nucleotidi

Caratteristiche del DNA Macromolecola, polimero di deossi-ribonucleotidi 4 nucleotidi: adenosina, citosina, guanosina, timidina Appaiamento A-T e G-C (Regola della complementarietà o di Chargaff) Struttura a doppia elica

Appaiamento G-C ed A-T

il “CROMOSOMA BATTERICO” (nucleoide) Il DNA di un microrganismo è concentrato in un’unica molecola, il cromosoma batterico (alcuni batteri possono avere 2 cromosomi) - dimensioni tipiche: da 3 a 5.000.000 bp, (1.7 mm) il cromosoma è circolare (ma alcuni importanti gruppi hanno un cromosoma lineare) Il DNA è sempre associato a proteine, ma non è altamente organizzato come negli eucarioti

DNA batterico – domini superavvolti Figure: 07-10d Caption: Supercoiled DNA. (d) In actuality, the double-stranded DNA in the bacterial chromosome is arranged not in one supercoil but in several supercoiled domains, as shown here. In Escherichia coli over 50 supercoiled domains are thought to exist, each of which is stabilized by binding to specific proteins. DNA batterico – domini superavvolti

La replicazione del DNA è detta semiconservativa La duplicazione del DNA da parte del suo specifico macchinario enzimatico è detta replicazione Nel microrganismo, la replicazione del DNA è associata alla sua riproduzione, che avviene per scissione binaria. La replicazione del DNA è semiconservativa: cioè ognuna delle due eliche complementari di una molecola di DNA servirà da “stampo” per una nuova elica.

La replicazione del DNA dipende dalle DNA polimerasi La sintesi della nuova elica di DNA procede in direzione 5‘-3‘ Viene catalizzata dalle DNA polimerasi (almeno 3 enzimi differenti con questa funzione in E. coli) Le DNA polimerasi sono solo parte di un macchinario replicativo molto complesso che coinvolge numerosi altri enzimi e proteine (DNA girasi, elicasi, SSB protein, etc.) Richiedono dNTP‘s come precursori della sintesi della macromolecola, un‘elica di DNA „stampo“ e un „primer“ (RNA) da cui può partire la sintesi della nuova elica

Problemi legati alla replicazione in direzione 5‘-3‘ „Frammenti di Okazaki“

I PLASMIDI Molti batteri oltre al cromosoma contengono molecole di DNA più piccole (da 1-2,000 a 100-500,000 pdb), dette plasmidi. Queste molecole non sono indispensabili per le funzioni fondamentali del batterio (ceppi della stessa specie possono esserne privi). I plasmidi sono generalmente molecole di DNA circolare e superavvolto. I plasmidi replicano indipendentemente dal cromosoma del batterio, anche se necessitano del medesimo “macchinario enzimatico” del cromosoma perché avvenga la loro replicazione.

Funzioni codificate dai plasmidi I plasmidi possono codificare per diverse funzioni che conferiscono al batterio nuove proprietà: RESISTENZA AD ANTIBIOTICI E, SOSTANZE TOSSICHE, RADIAZIONI… CAPACITA’ DI PRODURRE ANTIBIOTICI, TOSSINE, FATTORI DI VIRULENZA… NUOVE CAPACITA’ METABOLICHE …

Ma tornando al cromosoma batterico…….. Perché è così importante il DNA? Perché contiene l’informazione genetica….. Un gene da un punto di vista “genetico”: GENE= unità fondamentale dell’informazione genetica Tipicamente un gene corrisponde ad una proteina (o ad un RNA con funzione specifica) Un gene da un punto di vista “biochimico”: Sequenze di DNA che, una volta trascritte e tradotte contengono l’informazione minima necessaria per la produzione di una proteina specifica

Il genoma batterico medio Genoma=insieme dei geni di un organismo Un batterio come Escherichia coli possiede un genoma di 4.300.000 bp circa che codifica per circa 4300 geni 1 gene medio=1000 nucleotidi (regioni non-codificanti escluse)

Sequenziamento genomico Il DNA contiene l’informazione genica di un organismo, contenuta nelle sue specifiche sequenze nucleotidiche. Conoscere la sequenza di un genoma (l’insieme dei geni di un organismo) ci permette di avere importanti informazioni sulla sua biologia. A tutt’oggi sono state rese disponibili le sequenze di circa 500 microrganismi.

Interpretazione delle sequenze di DNA 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ AATAAAAATTTAACTCAATTTGTATCAAAAAATAACAGAAATCTAGCAGTTTTTGTAT TTTATTTTTAAATTGAGTTAAACATAGTTTTTTATTGTCTTTAGATCGTCAAAAACATA 3’ 5’ 5’ 3’ TTGCTGCTGGTGCTGCAATGGCTGATGAAGCTGTTGTTCATGACAGTTATGCATTCG AACGACGACCACGACGTTACCGACTACTTCGACAACAAGTACTGTCAATACGTAAGC 3’

Sequenze codificanti e non-codificanti nel genoma batterico = 1000 bp Geni: CDS= Coding Sequences ORF= Open Reading Frames N.B.: nei microrganismi le sequenze geniche non presentano interruzioni (es. da sequenze introniche)

Che cosa ci permette di identificare le sequenze codificanti (cioè i geni) da una sequenza di DNA? Risposta: Dalla nostra conoscenza del codice genetico! AUG o GUG (ATG e GTG nel DNA) sono il codone di inizio per la sintesi proteica UAA (TAA), UAG (TAG) e UGA (TGA) sono i codoni di stop

Una “Open Reading Frame”, cioè una “lunga” sequenza di codoni in frame rappresenta un potenziale gene 921 paia di basi GTG CGA ATA AAT TTC GCA CAA……………………........GGC TAC TAA Met Arg Ile Asn Phe Ala Gln……………………………Gly Tyr STOP 307 amino acidi

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale L’organizzazione di geni in operoni è tipica dei Bacteria. Il numero di geni presente in un operone è variabile (2-15 geni) Generalmente i geni di un operone codificano per proteine con funzioni correlate tra loro (es. enzimi di una stessa via metabolica)

Il flusso dell’informazione: l’espressione genica La trascrizione

L’espressione genica: la “messa in atto” dell’informazione contenuta nel DNA

Quali sequenze di DNA vengono trascritte? A) tutto il DNA B) le sequenze codificanti geni C) le sequenze codificanti ed una parte delle sequenze non codificanti (quali? Dove comincia e dove finisce la trascrizione?)

I „confini“ di un gene (coding sequence) sono molto chiari… Un gene è identificabile dalla presenza di un codone di inizio (ATG, più raramente GTG) che dà inizio ad una sequenza codificante più o meno lunga, che termina con un segnale di stop (TAA, TAG o TGA). Il gene fa parte di un „trascritto“ (una molecola di RNA) che parte da un promotore e finisce ad un terminatore (il trascritto può comprendere più geni che appartengono allo stesso operone) L‘enzima responsabile del processo di trascrizione prende il nome di RNA polimerasi

L‘RNA polimerasi è un enzima complesso e composto da diverse subunità w b‘ s

L‘RNA polimerasi è un enzima complesso e composto da diverse subunità Il complesso a2bb‘(w) possiede l‘attività catalitica per la sintesi dell‘RNA da una molecola stampo di DNA e viene definito „core enzyme“ Non è però in grado di legare i promotori (siti di inizio della trascrizione) in assenza della subunità (o fattore) s. L‘assemblaggio di questa subunità porta alla formazione del cosiddetto oloenzima w b‘ a s

I tre momenti base del processo di trascrizione 1: Denaturazione locale del DNA 2: Inizio della trascrizione (pol. di 20 nt di RNA circa) 3: Allungamento della molecola di RNA nascente

La trascrizione è un processo „asimmetrico“ Template strand/elica stampo a b b‘ w Coding strand

Il core enzyme è in grado di legare il DNA ma non di iniziare la trascrizione b b‘ w Complesso chiuso a b b‘ w s Complesso aperto

A sua volta, l‘inizio della trascrizione si compone di diverse reazioni Fattore s Core Enzyme

Alcuni antibiotici inibiscono l‘RNA polimerasi (es. Rifampicina) Antibiotico scoperto in Italia negli anni 60 Fondamentale per capire meccanismo di trascrizione (ne inibisce l‘inizio) Utilizzato per gran parte delle infezioni batteriche („Rifocin“) fino a metà anni 70 Abbandonato per alta frequenza di batteri resistenti A tutt‘oggi principale antibiotico nella cura della tubercolosi a b b‘ s w

Il sito di inizio della trascrizione: il promotore

Il „mappaggio“ dei promotori

Il “Promotore perfetto” (?) UP element -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt Riconosciuto dalla subunità a Riconosciuti dalla subunità s

Come si ferma una macchina in corsa? Il terminatore

Terminazione “intrinseca” (rho-indipendente)

Terminazione dipendente dal fattore Rho (r)

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale L’organizzazione di geni in operoni è tipica dei Bacteria. Il numero di geni presente in un operone è variabile (2-15 geni) Generalmente i geni di un operone codificano per proteine con funzioni correlate tra loro (es. enzimi di una stessa via metabolica)

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale e controllati da un unico promotore = presenza di un promotore

La trascrizione negli Archaea Somiglianze con eucarioti Maggiore complessità dell’RNA polimerasi (circa 12 subunità assemblate in modi alternativi) introni presenti in alcuni geni Insensibilità a rifampicina e ad altri antibiotici che inibiscono la trascrizione dei batteri Ma anche…..somiglianze con i procarioti mRNA policistronico