PEPTIDE SYNTHESIS

PEPTIDI Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100 circa), uniti tra di loro attraverso un legame peptidico (amidico).

PEPTIDI Costituenti delle proteine Ormoni Neurotrasmettitori Antibiotici/Antibatterici Veleni Partecipano alla risposta immunitaria Sviluppo di patologie Farmaci Nanotecnologie

PEPTIDI Ormoni Glucagone Insulina

PEPTIDI Neurotrasmettitori Sintetizzati come pre-proteine del reticolo endoplasmatico rugoso dove viene rimossa la sequenza segnale. La pre-proteina risultante attraversa l’apparato di Golgi e viene immagazzinata in vescicole. All’interno delle vescicole si completa la formazione del peptide: scissione proteolitica, modificazione delle estremità del peptide, glicosilazione, fosforilazione, formazione dei ponti disolfuro.

PEPTIDI Antibatterici Proline-rich proteins Istatine Cistatine

PEPTIDI Veleni Conopeptidi

PEPTIDI Risposta immunitaria

Patologie legate ai peptidi: Alzheimer

PEPTIDI Insulina Ossitocina Antagonisti GnRH Peptide Radionuclide Farmaci Insulina Ossitocina Antagonisti GnRH Peptide Radionuclide Receptor Therapy Somatostatina Ziconotide

PEPTIDI Farmaci Peptide Peptidomimetico bassa stabilità metabolica scarso assorbimento dopo somministrazione orale scarso passaggio della barriera ematoencefalica Peptide Peptidomimetico

PEPTIDI Nanotecnologie

C'ERA UNA VOLTA...

1881 & 1902 Prima attivazione del gruppo carbossilico & Sintesi di un tripeptide Theodor Curtius (1857-1928)

Prima sintesi chimica di un peptide “NH2 free” 1901 Prima sintesi chimica di un peptide “NH2 free” Emil Fischer (1852–1919) 1902 Nobel Prize “…la quantità di lavoro che c’è da fare è talmente enorme che in confronto le scoperte sui carboidrati sembrano un gioco da ragazzi.”

Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z) 1932 Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z) Max Bergmann (1886-1944) & Leonidas Zervas (1902-1980)

Sintesi dell’Ossitocina Vincent du Vigneaud (1901-1978) 1953 Sintesi dell’Ossitocina Vincent du Vigneaud (1901-1978) 1955 Nobel Prize

Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc) 1957 Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc) George W. Anderson & Anne McGregor J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 6180-6183

1963 J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149 - 2154 L-A-G-V

BRUCE MERRIFIELD (1921-2006) 1984 Nobel Prize

Work-up per semplice filtrazione BRUCE MERRIFIELD “la mia resa complessiva è stata del 7% e mi ci sono voluti 11 mesi. Sicuramente un chimico dei peptidi con più esperienza avrebbe fatto meglio, ma non senza uno sforzo considerevole” Legare covalentemente un aa ad un supporto insolubile e far “crescere” il peptide. VANTAGGI Work-up per semplice filtrazione Possibiltà di utilizzare i reattivi in grande eccesso Riduzione dei tempi di sintesi Automatizzazione del processo

LE TRE GRANDI SFIDE Bruce contro i chimici!!! Passare dalla teoria alla pratica. Abbattere la resistenza dei chimici sintetici verso questo nuovo metodo (“…non è assolutamente chimica, è un approccio che verrà soppresso dalla comunità”). Far capire che anche un biochimico può avere le credenziali per proporre un cambiamento rivoluzionario nella sintesi chimica (“Questo non è il modo di sintetizzare i peptidi”).

Attacco –COOH. Allungamento facendo reagire il carbossile attivato con gruppo NH2 dell’aa o del peptide ancorato alla resina. SPPS: sequenza di coupling/deprotezione. Distacco del peptide dalla resina L-A-G-V

Introduzione del gruppo 9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) 1972 Introduzione del gruppo 9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) Louis A. Carpino

SPPS Side chain PG N-α PG Polymer Support couple CH C O R1 Linker HN activating group couple n. times deprotection and coulping Rx+1 Rx OH n-1 SPPS Side chain PG N-α PG Polymer Support

SPPS Boc/Bzl SPPS Fmoc/tBu SPPS SCELTA DELLA RESINA ALLUNGAMENTO DELLA CATENA (COUPLING/DEPROTEZIONE) DISTACCO DEL PEPTIDE DALLA RESINA PURIFICAZIONE Boc/Bzl SPPS GIOCO DI PROTEZIONI Fmoc/tBu SPPS

-N- -OH -COOH R -SH

PROTEZIONE ORTOGONALE GRUPPO PROTETTORE chimicamente stabile nelle condizioni della sintesi peptidica effetto stabilizzante sulla molecola rimovibile in condizioni blande, in modo selettivo e con alte rese PROTEZIONE ORTOGONALE Stabile nelle condizioni di coupling e deprotezione Non stabile durante il distacco dalla resina (ci sono eccezioni) Stabile durante coupling Non stabile durante la deprotezione

Gruppi N protettori Boc Fmoc Stabile in ambiente basico e riducente Eliminazione in ambiente acido (TFA) Stabile in ambiente acido Eliminazione con piperidina

Gruppi protettori delle catene laterali Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ala, Met non hanno bisogno di protezione Boc Fmoc stabili in TFA Stabili in piperidina Possono essere o non essere stabili nelle condizioni di cleavage della resina

Racemizzazione Ossazolone

tBu Bzl 2-Br-Bzl Trt

Cbz Boc Dnp For Trt

Bzl tBu Ada OcHx

Trt Xan Tmob

Mts Pmc Pbf

Acm Trt

Scelta della Resina Non deve essere solubile nei solventi utilizzati durante la sintesi Deve contenere siti reattivi (linkers) per permettere l’attacco del primo aa tramite la funzione carbossilica Deve essere stabile nelle condizioni di coupling-deprotezione La resina deve subire un rigonfiamento (swelling) per favorire la penetrazione dei reagenti nei granuli Loading: mmol di gruppo funzionale per g di resina

Scelta della Resina Struttura polimerica Polistirene PEG

Resine Boc-SPPS Stabili in TFA Resina di Merrifield

Resine Boc-SPPS

Resine Boc-SPPS Cleavage HF → Peptide acido NH3/MeOH → Peptide carbossammide NH2NH2 → Peptide idrazide MeOH/TEA → Peptide metilestere

Resine Fmoc-SPPS Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm Resina di Wang Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm

Anidridi simmetriche Resa >70% Racemizzazione

Anidridi miste Resa >70% Racemizzazione

Metodo MSNT/MeIm Evita racemizzazione Sensibile all’umidità

Resina Clorotritilica Peptidi acidi No racemizzazione Resa quantitativa Peptidi protetti

Rink Amide Resin Sieber Amide Resin Peptidi carbossiammidati Peptidi protetti (Sieber)

Resine Fmoc-SPPS Cleavage TFA 80-95% + Scavengers per 1-3 h Scavengers Nucleofili che reagiscono con specie cationiche altamente reattive che si formano dai gruppi protettori e dalla resina Acqua 1,2 Etanditiolo (EDT) Tioanisolo Fenolo Triisopropilsilano (TIS) Reagent K TFA/tioanisolo/H2O/Fenolo/EDT 82.5 5 5 5 2.5

Coupling Gruppo attivatore

Carbodiimmidi DIC EDC DCC O-acilisourea Migrazione acilica O → N Base O-acilisourea Base: DIEA, TEA, NMM, DMAP Migrazione acilica O → N Racemizzazione

Carbodiimmidi + HOBt HOAt HOSu HOOBt

Miscellanea

Coupling Reagents HOBt incorporato direttamente nella struttura dell’attivatore Sali di fosfonio BOP Sali di uronio HBTU

Sali di Fosfonio PyBOP

Sali di Uronio HATU TBTU HCTU

Siamo pronti! Fase liquida Fase Solida 1.1 eq. aa 1.1 eq. attivatore 1.1 eq. HOBt 2 eq. ammina 5 eq. aa 5 eq. attivatore 5 eq. HOBt 10 eq. ammina Gruppo COOH terminale protetto come estere Gruppo COOH terminale attaccato a resina Work-up: estrazione, purificazione Work-up: filtrazione

Problemi Sintesi in fase liquida: Solubilità del peptide Sintesi in fase solida: Capacità del gruppo amminico di affacciarsi al solvente

Risoluzione (Hmb)-amminoacidi Pseudoproline Isoacil dipeptidi Evitare la formazione di legami idrogeno intermolecolari (Hmb)-amminoacidi Pseudoproline Isoacil dipeptidi Microonde

2-Hydroxy-4-methoxybenzyl (Hmb)-amminoacidi 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl N → O acyl transfer

Pseudoproline X= H, CH3

Pseudoproline

Isoacil Dipeptidi

Microonde

Ponti S-S Contribuiscono alla formazione della struttura tridimensionale di peptidi e proteine Importanti per l’attività Ossidazione di due residui di cisteina

2 AcOH/H2O I2, MeOH Ac. Ascorbico 1 H2O (40 μM) NaOH, TRIS H2O2

Distacco del gruppo Boc Si aggiunge alla resina una soluzione di TFA in DCM (50%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora TFA/DCM e si agita per ulteriori 20 min. La resina viene poi lavata con DCM (2x) e IPA (2x).

Distacco del gruppo Boc (Fase liquida) L’ammina N-Boc-protetta viene posta in un pallone ad un collo e raffreddata a 0°C con un bagno di ghiaccio. Successivamente viene aggiunta una soluzione di HCl in diossano (4M, 1mL per 100 mg) e la miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione, a t.a. fino a quando la TLC non ha evidenziato la scomparsa del prodotto di partenza. Il solvente viene fatto evaporare ( HCl!) e il residuo ottenuto lavato con Et2O (x3).

Distacco del gruppo Fmoc Si aggiunge alla resina una soluzione di piperidina in DMF (40%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora piperidina/DMF e si agita per ulteriori 15 min. La resina viene poi lavata con DMF (6x)

Introduzione del gruppo Boc L’ammina libera viene dissolta in un solvente opportuno (10 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunta TEA (1 o 2 eq.) fino a pH basico ed infine Boc2O (2 eq.). La miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione overnight. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) si lava la fase organica con H20 e una soluzione satura di NaCl. La fase organica viene seccata con Na2SO4 anidro e fatta evaporare. Il grezzo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.

Introduzione del gruppo Fmoc L’ammina cloridrata viene dissolta in una soluzione di Na2CO3 (0.6M, 7 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunto FmocOSu (2 eq.) sciolto in acetone (5 mL/mmol). La miscela di reazione è lasciata sotto agitazione per 24 h. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) la miscela viene diluita con H2O e la fase acquosa estratta con AcOEt (3x). Le fasi organiche riunite vengono lavate con H2O e una soluzione satura di NaCl, seccate con Na2SO4 e fatte evaporare. Il residuo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.