Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Docenti (in ordine di apparizione): P. Landini applicazioni biotecnologiche in batteri (produzione di proteine eterologhe, biosensori) C. Compagno* applicazioni biotecnologiche in lieviti S. Donadio biologia degli Streptomiceti e produzione di antibiotici * Docente responsabile del corso: concetta.compagno@unimi.it

Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Corso modulare (argomenti diversi trattati nelle diverse parti del corso) Scopo del corso: fornire elementi su strategie e processi biotecnologici con diretti riferimenti ad applicazioni pratiche. Requisiti del corso: buone reminescenze di microbiologia, biochimica, biologia molecolare.

Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Materiale Didattico: Testo di Microbiologia generale, parti riguardanti ingegneria genetica, regolazione genica, crescita batterica, microbiologia industriale (Brock, Cap. 4, 7-8). Materiale didattico a cura dei docenti (es. articoli scientifici, link a siti internet) Le mie presentazioni sono disponibili al sito: http://users.unimi.it/biofilms/ ( Didattica Biotecnologie Microbiche)

Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Modalità d’esame: Prova scritta Tre domande (una per ciascuna parte del corso) Due ore di tempo Un esempio di esame verrà distribuito ed eventualmente discusso con i docenti

P. Landini (paolo. landini@unimi P. Landini (paolo.landini@unimi.it) Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Biotecnologie microbiche con applicazione industriale: Produzione proteine eterologhe Produzione di molecole ad interesse biotecnologico/industriale (bioconversione) Biotecnologie microbiche con applicazione ambientale: Biorisanamento ed utilizzo di biosensori Periodo: 27/9-11/10 (il 5/10 non c’è lezione)

Applicazioni biotecnologie con microrganismi procarioti Escherichia coli, Bacillus subtilis con altri batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus possono essere usati: piani di risanamento ambientale (bioremediation/biosensori) produzione di prodotti industriali: es. polidrossialcanoati (plastiche biodegradabili), polisaccaridi (gomme ), cellulosa In agricoltura: pratiche di biocontrollo e preservazione delle colture (Pseudomonas) Biotecnologie alimentari, probiotici, “drug delivery” produzione di proteine eterologhe (ricombinanti)

Applicazioni biotecnologie con batteri Gram-negativi: proteine eterologhe Una delle speci batteriche più “biotecnologica” è senza dubbio Escherichia coli Ospite per l’espressione di proteine eterologhe sia procariotiche che eucariotiche d’interesse biotecnologico

Qual è lo scopo dell’espressione di proteine eterologhe in E. coli? Ottenere una certa quantità di un prodotto proteico d’interesse purificato: ad es. enzimi catalitici per industria e ricerca (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es insulina), produzione di vaccini Utilizzare le cellule intere di E. coli che esprimono un certo enzima eterologo come biocatalizzatori (biotrasformazioni) al fine di produrre molecole organiche di alto valore aggiunto (Vitamina C, aspartame).

Perché utilizzare Escherichia coli? (o comunque microrganismi?) La produzione di proteine eterologhe (soprattutto per usi industriali) richiede processi che diano rese alte sia quantitativamente che qualitativamente (cioè proteina integra e biologicamente attiva) I microrganismi garantiscono il soddisfacimento di questi requisiti per: facilità di crescita, ottenimento di grandi quantità di biomassa, facilità di recupero/purificazione della proteina di interesse. Vantaggi economici ed “etici”.

Come si arriva alla produzione di proteine di interesse (eterologhe) nell’ospite (es. E. coli?) Clonaggio del gene corrispondente In modo che: Il gene venga espresso e la proteina prodotta in maniera riproducibile ed affidabile La proteina sia stabile e biologicamente attiva La proteina sia purificabile e (facilmente) riestrabile dal bioreattore

Escherichia coli: g-proteobacteria Batterio enterico Bastoncello Gram negativo Mobilità flagellare

Escherichia coli (TEM x 92,750)

Escherichia coli Batterio Gram-negativo Enterobatterio Bastoncello dimensioni 1 x 3 mm Anaerobio facoltativo Metabolismo sia respiratorio (resp. aerobica ed anaerobica) che fermentativo 3 mm Agitazione (O2) 3x109 cells/ml Statico 3x108 cells/ml tempo LogN Capacità di crescere in terreni definiti (minimi) Elevata velocità di crescita (tempo di generazione 20-30 minuti in terreno ricco)

Escherichia coli Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Presenza di plasmidi stabili 3 mm http://genolist.pasteur.fr/Colibri/

Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA (DIMENSIONI ca. 103-104 kBp) DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni biotecnologiche: 50-250 copie/cellula) GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI) bla= resist. ampicillina ColE1= origine di replicazione

La regione di importanza “clou” del vettore d’espressione: il Multiple Cloning Site (MCS) Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore d’espressione a valle di un promotore specifico. A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)

L’uso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA ricombinante Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento. Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5’ o 3’) o taglio “blunt end”.

L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse

Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

Cosa occorre per l’espressione ad alto livello di una proteina nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilità Promotore forte (trascrizione) Presenza di segnali per il riconoscimento dell’mRNA da parte dei ribosomi (traduzione) Assenza di proteasi specifiche (stabilità)

Il “Promotore perfetto” (?) UP element -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt Riconosciuto dalla subunità a Riconosciuti dalla subunità s +1 5-7 nt An....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term. (Ribosome Binding Site/ SD box (Shine-Dalgarno) Terminatore di trascrizione

Produzione di proteine eterologhe Domanda: Un sistema “spinto al massimo”, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine eterologhe? Risposta: NO Problemi di “tossicità” di proteine eterologhe, e della loro conformazione corretta

Tossicità di proteine eterologhe nell’ospite Escherichia coli Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Interazione “erronea” con componenti cellulari: Legame al DNA Danno al DNA Stress ossidativo Interazione/sequestro di altre proteine essenziali Induzione di sistemi di risposta allo stress

Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Crescita non inibita Crescita rallentata Produzione di proteina (unità arbitrarie) Crescita bloccata e/o lisi cellulare

Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

Plac, il promotore inducibile „per eccellenza“ (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG)

Plac Ptac Ptrc IPTG LacI Derivati di Plac* più forti *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi

Phage T7

Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dell’RNA polimerasi batterica)

AraC Ara C Ara represses PBAD +Ara induces PBAD PBAD AraC RNA pol PBAD

EK=Sito di proteasi Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici

L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Ma troviamo sempre siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?

Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain reaction) 1 2 3 (15-20 nt) DNA-sintesi Ibridazione con sonde specifiche per l’amplificazione del gene bersaglio

Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: AAGCTT GGATCC (HindIII) (BamHI) AAGCTT GGATCC AAGCTT AAGCTT GGATCC GGATCC Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: AAGCTT GGATCC (HindIII) (BamHI) GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare