ETILENE: un ormone gassoso Germinelli esposti all’etilene mostrano una serie di cambiamenti morfologici denominati collettivamente come risposta tripla

Pisello

Ricerca di mutanti nella via dell’etilene La risposta tripla che consiste in: Ipocotile corto e rigonfiato Uncino apicale esagerato radici più corte / crescita orizzontale delle radici Arabidopsis Mutante etr1 + 10 ppm etilene Ricerca di mutanti nella via dell’etilene

ctr1 (constitutive triple response1)

WT (senza e con etilene) L’incurvamento dell’apice è dovuto all’accrescimento asimmetrico causato dall’etilene (parte esterna cresce di più della parte interna) La crescita delle cellule della parte interna è inibita a causa della presenza di etilene La luce rossa inibisce la formazione dell’etilene e quindi promuove l’accrescimento della parte interna  il gancio si apre

Ormoni e fotomorfogenesi: auxina La formazione del gancio potrebbe dipendere da un gradiente di auxina dipendente dall’etilene (analogo al gradiente laterale di auxina che si forma durante la curva fototropica), infatti: se KO: niente gancio apicale e alterata pattern di geni che rispondono all’auxina Se OE: gancio costitutivo in assenza di etilene Hookless (hls1) con etilene

Via di biosintesi dell’Etilene

Degradazione dell’Etilene

Altri effetti Promozione della formazione di peli radicali Epinastia: foglie incurvate in basso

L’etilene viene prodotto in condizioni di stress ACC è il precursore dell’etilene (es anossia da allagamento)

Abscissione delle foglie indotta da etilene: Trattando una pianta con etilene si causa l’abscissione delle foglie wt etr1 Una pianta che esprime un recettore insensibile diventa insensibile all’etilene

Due-tre file di cellule degradano la parete e i protoplasti si rigonfiano respingendo le due parti

Domesticazione Cereale selvatico La domesticazione comporta quasi sempre la mancata formazione degli strati di abscissione a livello del seme Frumento coltivato

Early domestication event Le varietà di riso Nipponbare e Kasalath differiscono per la facilità con cui perdono il seme a maturità Trovata una mutazione puntiforme nel promotore che impedisce l’attacco di un regolatore trascrizionale Il gene non è più espresso nel tessuto e non si forma più il layer di abscissione a livello del seme Just one base change out of 15,000 Konishi et al., (2006) Science 312:1392-1396

Maturazione dei frutti Diversi frutti hanno un picco di produzione dell’etilene di tipo autocatalitico. Aumenta la respirazione (consumo di O2 e produzione di CO2).

I frutti climatterici producono etilene quando maturano (e rispondono all’etilene accelerando la maturazione) Il pomodoro in cui l’ACC ossidasi è inibita non matura completamente, ma matura se esposto all’etilene.

Climaterio: produzione di etilene I frutti non climaterici non hanno un aumento della produzione di etilene e della respirazione

Diversi gruppi lavorano su etilene e maturazione Wild type (left) and antisense ACC oxidase (right) melons harvested 38 days post-pollination, stored at 25ºC for 10 days. http://www.biomatnet.org/secure/Fair/S1146.htm Protasio Pereira et al., (2005) Ethylene production and Acc oxidase gene expression during fruit ripening of Coffea arabica L. Braz. J. Plant Physiol. 17:283-289. http://www.hku.hk/rss/res_proj/86/86.htm

Quali sono i componenti della via dell’etilene? Il prodotto del gene Etr1 era il miglior candidato per il recettore: la proteina espressa in lievito lega etilene

Etr: sistema a due componenti His-kinasi

ctr1 è un regolatore negativo della via Eto (ethylene overproducer) Constitutive triple response in the absence of the hormone (CTR1) ctr1 è un regolatore negativo della via

Diversi alleli etr1 tendono a mostrare lo stesso fenotipo Insensitive mutants that do not show a triple response in the presence of ethylene (ETR1, ETR2, EIN4, EIN2, EIN3, EIN5, EIN6, EIN7) Diversi alleli etr1 tendono a mostrare lo stesso fenotipo

Epistasi!! Via di trasduzione del segnale per l’etilene Ctr1 è un regolatore negativo inattivato dall’etilene La sovraespressione di SIMKK equivale alla inattivazione di CTR1 (vedi due slide prima) Epistasi!!

Effetti sui canali anionici (potenziale di membrana)

Applicazioni commerciali Maturazione dei frutti (accelerata o rallentata) Senescenza dei fiori STS = Tiosolfato d’argento (inibisce l’azione dell’etilene)

Etilene e inibitori della sua azione sono usati per accelerare o ritardare la maturazione dei frutti Etephon http://postharvest.ucdavis.edu/Produce/ProduceFacts/Veg/full_tomatoethephon.shtml

Factors affecting ethylene biosynthesis Stimulation of ethylene biosynthesis by: developmental state (fruit ripening) environmental conditions (stress) other plant hormones (auxin, cytokinin) physical and chemical injury (wounding)

Gibberelline

Up to 40% of the yield of rice was lost due to this disease Pianta di riso infettata dal fungo Gibberella fujikuroi che causa la malattia nota come “piantina sciocca” (pianta molto più alta e senza semi) Da filtrati di coltura del fungo è stato isolato nel 1938 l’acido gibberellico. In seguito si sono isolate le gibberelline anche dalle piante (oltre 120 molecole diverse, ma tutte simili)

Biosintesi delle gibberelline in pianta Acido Abscissico Etilene da Met, Auxina da Trp, citokinina da ATP/ADP e DMAPP

GGPP plastidiale La disponibilità di un saggio biologico ha permesso la quantificazione delle attività e la purificazione delle varie forme GA1

Tutte le gibberelline conosciute hanno uno scheletro derivato dall’ent-kaurene con 20 o 19 atomi di C Nelle GA C19 il C20 è stato rimosso per ossidazione e forma un anello lattonico con il carbossile in C19

Effetti delle Gibberelline GA promuove allungamento dello scapo fiorale Le gibberelline stimolano l’allungamento degli internodi Specialmente in piante nane o con gli internodi corti

Mutanti della via biosintetica ga5 e ga4 hanno un fenotipo debole perchè esistono diverse isoforme in verde i mutanti di Arabidopsis

Dove è espresso Cps (copalil-PP sintasi)?  in quei tessuti che accumulano maggiormente gibberellina Meristema Antere Embrione Semi

I mutanti nani di Mendel sono un esempio di via biosintetica bloccata Il mutante le è nano perchè non sintetizza GA1. Il trattamento con GA1 recupera il fenotipo. Mutante le di pisello Il contenuto di GA1 correla con la lunghezza degli internodi

Effetti su:  germinazione  allungamento ipocotile transizione di fase: da crescita vegetativa a riproduttiva  crescita Le gibberelline sono presenti nei tessuti vegetali - Semi immaturi: ppm - Tessuti vegetativi: 1-10 ppb Il trattamento con gibberelline: - accorcia la fase giovanile - influenza la determinazione del sesso - stimola sviluppo del polline - germinazione di semi - fruttificazione e partenocarpia - ritarda la senescenza di fiori e frutti

La transizione da fase vegetativa a fase riproduttiva è sensibile a molti fattori: stimoli come un periodo freddo, l’accorciamento (o l’allungamento) dei giorni, lo stress idrico (siccità) e il trattamento con ormoni possono causare la transizione Short day Long day Screening di mutanti di Arabidopsis che non fiorivano mai o che fiorivano precocemente

Alcuni esempi di mutanti Mutante cpl3 (caprice-like3) gigantea (fiorisce tardi) Alcuni esempi di mutanti Quali altri mutanti sono alterati nella fioritura? Fitocromo e Criptocromo (cry2 is late flowering in LD) Early flowering and larger (endoreduplication) “Fascismo molecolare” lhy cca1 (early flowering) http://www.mpg.de/bilderBerichteDokumente/multimedial/bilderWissenschaft/2004/02/Coupland1/Web_Zoom.jpeg

Es. il freddo (inverno) stimola la sintesi di GA e induce la fioritura Regolazione long days (via fitocromo) e freddo (inverno) es: cavolo biennale Molti stimoli ambientali vengono tradotti poi in cambiamenti negli ormoni: Es. il freddo (inverno) stimola la sintesi di GA e induce la fioritura Piante “winter annual” senza vernalizzazione vanno in fioritura molto più tardivamente. L’induzione è la combinazione dello stimolo da fotoperiodo e di quello da freddo

Temperatura 0 giorni di vernalizzazione 100 giorni di vernalizzazione a 4°C Arabidopsis found in cooler temperate regions often do not flower until exposed to a period of cool winter temperatures

Mutanti di Arabidopsis thaliana alterati nella fioritura Putterill et al. (2004) Moltissimi geni sono implicati nel controllo della fioritura

Come la durata del giorno influenza la fioritura in A. thaliana? La durata del giorno determina il ritmo circadiano ce viene misurato attraverso PhyB e Cry. Questo a sua volta influenza la fioritura regolando la trascrizione di FKF1 In sunlight most P gets converted to Pfr form. After a long night most reverts to Pr. At dawn, most P gets converted to Pfr again. L’effetto del ritmo circadiano sulla fioritura è mediato dalle proteine FKF1, CONSTANS (CO) e FLOWERING LOCUS T (FT)

Mutante in FRI Li5: allele Fri non funzionale A requirement for vernalization—the acceleration of flowering that occurs during a 3- to 8-week period of cold temperature (4°C)—has been bred in many crops to produce winter/spring varieties. Mutante in FRI Li5: allele Fri non funzionale Li5 con allele Fri funzionale In Arabidopsis la dipendenza dalla vernalizzazione è dovuta a un singolo locus Introduction of H51 FRI allele into Li5. Wild-type Li5 is shown on the left. A late-flowering primary transformant following Agrobacterium-mediated transformation of Li5 with a functional FRI allele is shown on the right. Both plants were photographed once they had flowered (after 3 months for the transformant and 3 weeks for the parent) Johanson et al. (2000) Molecular analysis of FRIGIDA, a major determinant of natural variation in Arabidopsis flowering time. Science. 290(5490):344-7.

FLD: fenotipo dei mutanti Phenotype of fld mutants. (A) fld mutants flower later than wild-type plants in long days. (B) A single node on the main inflorescence stem of fld-3 showing an aerial rosette. (C) FLC dependence of fld phenotype. The fld-1 flc-3 double mutant flowers early like flc-3.

Vie / geni che regolano la fioritura

Fitocromo e GA Concentrazione degli intermedi delle gibberelline o della GA1 (attiva) Trascrizione della 3β idrossilasi (catalizza la conversione GA20  GA1 ) La stimolazione della germinazione mediata dal fitocromo in lattuga è mediata dall’aumento nella sintesi di GA

GA e fioritura Numerosi passaggi della sintesi di GA sono alterati dalla lunghezza del giorno: in Arabidopsis giorni lunghi aumentano l’espressione del gene GA20ox1  estensione del fusto e fioritura.

La manipolazione dei livelli di GA è un modo per ottenere mutanti nani La mutazione di geni coinvolti nel metabolismo / risposta alla gibberellina è alla base della rivoluzione verde IR8 (sd1) wild type a, Morphology of sd1-mutant rice plants: left, taichung 65 (wild type); right, IR8 (sd1). Scale bar, 60 cm. b, Linkage between GA20ox-2 and sd1 in the rice genome. Left, chromosomal location of GA20ox-2; GA20ox-2 co-segregates with RG220 on chromosome 1. Right, map position of sd1; sd1 is tightly linked to RG220 on chromosome 1 (ref. 10). cM, centimorgans. c, Mutation sites of the four sd1 alleles. The GA20ox-2 gene consists of three exons and two introns. The mutation in each allele is indicated by either an arrow (single-nucleotide substitution) or a line (internal deletion). d, Expression of GA20ox-2 in different organs. Amplification was by polymerase chain reaction with reverse transcription using first-strand complementary DNA derived from different organs. Products were detected by Southern blot DNA analysis; Green revolution: A mutant GA20-Ox gene in rice

`Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators control (var. Mercia) `Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators semi-dwarf Rht-B1b Gli alleli mutanti di Gai in frumento (Rht, Reduced height) e mais (D8) codificano per proteine con un N terminale alterato semi-dwarf Rht-D1b a, Near-isogenic dwarf wheat lines: left, tall control (var. Mercia); centre, semi-dwarf Rht-B1b ; right, semi-dwarf Rht-D1b. b, Gel-blot hybridization of C15-1 with Dra1 -digested DNA from wheat lines lacking individual group 4 chromosomes (nullisomic 4A-tetrasomic 4D, N4AT4D; nullisomic 4B-tetrasomic 4D, N4BT4D; nullisomic 4D-tetrasomic 4B, N4DT4B), and euploid control (all var. Chinese Spring). Hybridizing fragments were assigned to chromosomes (4A, 4B and 4D) as shown.

Mutanti di Arabidopsis Il mutante gai è una pianta nana. Il gene codifica per proteine DELLA

DELLA agisce come un repressore Quando GA interagisce con il recettore si lega a DELLA L’interazione porta alla degradazione di DELLA che non può più reprimere la trascrizione

Germinazione di semi (mobilizzazione delle riserve ) L’embrione può essere sostituito con GA Cellule dell’aleurone GA viene prodotta nell’embrione e agisce sull’endosperma promuovendo la trascrizione nell’aleurone di geni come l’ α-amilasi (dove l’enzima idrolizza l’amido)

La GA stimola la trascrizione L’aumento di mRNA di GAMYB precede l’aumento di trascrizione della α-amilasi.

Quali sono i messaggeri che partecipano alla trascrizione della α-amilasi?

Trasduzione del segnale Trasduzione del segnale della GA

Evidenze coinvolgimento proteine G: 1-Produzione α -amilasi indotta da GA è inibita da analogo GDP che lega subunità α delle proteine G ma non scambia con GTP 2- mutante Dwarf-1 in riso. Ha un difetto di sintesi della subunità α delle proteine G Calcio e cGMP: -aumentano entrambi in seguito a trattamento con GA -se tengo basso calcio, ho produzione α -amilasi ma non secrezione calcio cGMP GA

GA e la crescita La crescita dipendente da GA comporta sia l’allungamento che la divisione cellulare (aumena il numero di cellule e la loro lunghezza). L’allungamento è stimolato per primo ed è mediato da un aumento nell’estensibilità della parete (abbassano la soglia di cedevolezza).

L’applicazione di GA stimola la divisione cellulare L’auxina promuove la biosintesi di GA. Questo rende difficile separare l’effetto di un ormone dall’altro

Referenze http://www.botany.utoronto.ca/ResearchLabs/McCourtLab/Mothership/Pages/hormones.html http://plantphys.info/plant_physiology/gibberellin.shtml