Motilità e Citoscheletro MOVIMENTI INTRACELLULARI E MOTILITA’ DELLE CELLULE STESSE Indispensabili per la sopravvivenza di molti organismi Spermatozoo, globuli bianchi, neuroni CITOSCHELETRO Impalcatura interna delle cellule Supporto alle proteine motrici Assemblaggio e disassemblaggio delle proteine del CS producono movimento

Adesione e Matrice Extracellulare MOLECOLE DI ADESIONE: Cell-cell; cell-strutture circostanti Integrità e comunicazione tissutale MATRICE: Supporto, protezione, riserve energetiche, ancoraggio per cell e tessuti

CITOSCHELETRO: Sistema di filamenti che svolge funzioni sapaziali e meccaniche nella cellula organizzazione spaziale delle cellule forma e movimento riarrangiamento dei componenti interni durante la crescita e la divisione cellulare mitosi traffico intracellulare di organelli e molecole sostegno alla membrana plasmatica guida la crescita della parete cellulare vegetale Le diverse funzioni del citoscheletro si basano sul comportamento di tre famiglie di proteine che si assemblano a formare tre tipi principali di filamenti; ciascun tipo di filamenti ha proprietà meccaniche distinte e una dinamica diversa, ma certi principi fondamentali sono comuni a tutti.

FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO Filamenti di actina (microfilamenti): determinano la forma della superficie cellulare e sono necessari per la locomozione dell’intera cellula (lamellipodi, filipodi) Microtubuli: determinano le posizioni degli organelli e dirigono il trasporto intracellulare (formazione del fuso mitotico, cilgia e flagelli) Filamenti intermedi: forniscono forza meccanica e resistenza agli stress (involucro nucleare, assoni) Proteine accessorie sono essenziali per l’assemblaggio controllato dei filamenti del citoscheletro, comprendono i motori proteici che muovono gli organelli o i filamenti stessi. Strutture dinamiche e adattabili Cambiano o persistono per archi di tempo variabili Composte da diverse subunità macromolecolari Le caratteristiche di tali componenti unitarie conferiscono le proprietà del filamento finale Tutti e tre i tipi di filamenti del citoscheletro si formano come complessi elicoidali di subunità che si autoassociano, utilizzando una combinazione di contatti estremità-estremità o fianco-fianco. Differenze nelle forze che tengono unite le subunità determinano differenze cruciali nella stabilità e nelle proprietà meccaniche dei singoli filamenti.

Filamenti di Actina Polimeri elicoidali a 2 filamenti della proteina ACTINA Strutture flessibili 5-9nM Fasci lineari Reti bidimensionali Gel tridimensionaliconcentrati soprattutto nella corteccia

Microtubuli Cilindri cavi Unità: tubulina (alfa e beta) 25nM Rigidi MTOC: centrosoma

Filamenti Intermedi Unità: famiglia eterogenea di proteine 10nM Lamina nucleare, assoni, tessuti epiteliali

PROTOFILAMENTI I polimeri del citoscheletro sono costituiti lunghe file di subunità unite per le estremità, che si associano fra loro lateralmente. Tenute insieme da interazioni idrofobiche e legami non covalenti deboli Le posizioni e i tipi di contatti sono diversi per i diversi filamenti.

NUCLEAZIONE Assemblaggio di subunitàin un aggregato iniziale (o nucleo) Stabilizzazione dei contatti subunità-subunità Allungamento del polimero per aggiunta di altre subunità

NUCLEAZIONE la polimerizzazione dipende dalla concentrazione di subunità non polimeriche Concentrazione critica: quando il tasso di associazione e dissociazione si equivalgono Punto stazionario proteine speciali per catalizzare la nucleazione dei filamenti in siti specifici, determinando la posizione in cui si assemblano nuuovi filamenti del citoscheletro

POLARITA’ DEI FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO: il terminale con il tasso di polimerizzazione maggiore è detto terminale (+) (“plus end”);  il terminale con il tasso di polimerizzazione minore è detto terminale (- ) (“minus end”); MT: subunità alfa; Actina= estremità ATP

I filamenti del citoscheletro possono organizzarsi in strutture di ordine superiore: I filamenti intermedi formano legami crociati e si associano in fasci molto forti; associazione mediata anche da proteine come la filaggrina (forma fasci di filamenti di cheratina), la plectina (forma fasci di vimentina)… i filamenti di actina possono organizzarsi con proteine che formano fasci (legami crociatitra filamenti di actina)e proteine che formano gel (tengono insieme due filamenti di actina angolati tra loro)

Regolazione della dinamicità del citoscheletro (formazione di fasci, allungamento o accorciamento…) ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE: Cellule anucleate Circolano nel sangue Formano coaguli nei siti di ferite Contatto con vaso danneggiato o segnale chimico esterno (ex, trombina) = attivazione Cascata segnale Rapido influsso intracell di Ca2+ Attivazione delle proteine che regolano l’actina (inattivazione delle prot che bloccanono l’allungamento) Rapido allungamento dei filamenti di actina Formazione di fasci e reti di actina: lamellipodi e filipodi (inserimento nel sito del coagulo) Cessazione del segnale di attivazione (- Ca2+): stabilizzazione vs depolarizzazione e allungamento= piastrina bloccata nella nuova forma appiattita Miosina II: contrazione dei filamenti di actina = avvicinamenti dei bordi della ferita cui la piastrina è adesa

Attivazione delle piastrine

CONTATTI FOCALI: Tipo altamente specializzato di attacchi tra i filamenti di actina e matrice extracellulare che permette alle cellule di esercitare una trazione sul substrato a cui sono attaccate FIBRE DA STRESS: A livello dei contatti focali, consistono di fasci contrattili di filamenti di actina e di miosinaII che terminano in corrispondenza della membrana plasmaticadove si localizzano gruppi di proteine di adesione transmembrana (integrine). 15

Organizzazione dell’actina nella cellula

PROTEINE MOTRICI Motori molecolari Si associano alle fibre polarizzate del citoscheletro Usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per muoversi lungo di esse Si differenziano per il filamento a cui si attaccano, per la direzione in cui si muovono e per il cargo che portano Trasporto di componenti subcellulare (organelli, cromosomi…) Conferiscono forza alla rete dei polimeri: determinano la forma della cell dopo aver svolto l’azione motoria possono staccarsi dal filamento. DUE REGIONI: Testa: dominio motore (idrolisi dell’ATP) Coda: autoassemblaggio delle prot motrici; associazione al “cargo” Dà specificità ai diversi tipi di motore Spostamento del motore sul filamento (quando il filamento è ancorato) o del filamento stesso per mezzo dei motori (quando i motori soni ancorati).

Tipi principali di proteine motrici: Miosina Chinesina Dineina

Miosina (actina) Miosine: uniche proteine motrici che si muovono su binari di actina Diversi tipi di miosina: struttura e localizzazione Tutti i tipi di miosina si muovono verso l’estremità + di un filamento (differenti velocità) eccezione: miosina VI Miosina II: generazione della forza necessaria alla contrazione muscolare Prima proteina motrice identificata

Miosina II Proteina allungata formata da 2 catene pesanti (rosso) e 2 copie di 2 tipi di catene leggere (blu). Catena pesante: dominio di testa globulare all’N-terminale (motore) e una lunga sequenza amminoacidica che forma un coiled-coil -alfa eliche superavvolte- (media la dimerizzazione attrverso). Catene leggere: si legano vicino alle teste Sempre associata ad attività contrattile sia in cellule muscolari che non Citochinesi Divisione cellulare Migrazione cellulare

Filamenti spessi Le code possono formare un fascio con altre molecole di miosina (interazioni coda-coda= filamenti spessi bipolari)

Generazione della forza motrice Idrolisi ATP= cambio conformazionale Configurazione rigor No ATP La testa di Miosina lega saldamente il filamento di actina Durata breve (nel muscolo) Termina con l’attacco di un nucleotide trifosfato Legame ATP Cambio conformazionale lievedei domini che compongono il sito di attacco con l’actina Ridotta affinità actina-miosina Distacco: il movimento è consentito

Generazione della forza motrice Idrolisi ATP= cambio conformazionale Idrolisi=cambio conformazionale notevole Spostamento della testa sul filamento di 5nM ATP e Pi legano sempre la miosina Nuovo legame actina- miosina Rilascio del Pi Colpo di potenza

Generazione della forza motrice Colpo di potenza La testa di miosina riguadagne la conformazione iniziale sul filamento di actina No nucleotide La miosina lega l’actina in una nuova posizione Inizio di un nuovo ciclo

cellule multinucleate Miofibrilla Sarcomero Filamenti sottili: actina FIBRE MUSCOLARI cellule multinucleate Miofibrilla Sarcomero Filamenti sottili: actina Estremità + = disco Z (estremità del sarcomero) Estremità - = filamenti spessi Filamenti spessi: miosina II Accorciamento del sarcomereo (contrazione): scivolamento delle fibre (non accorciamento delle stesse) Processo dipendente dalla [Ca2+] 25

Banda chiara: filamenti sottili Disco Z: all’estremità del sarcomero, sito di attacco per le estremità+ dei filamenti sottili. Linea M: è la posizione di proteine che collegano filamenti adiacenti di miosina fra loro. Banda chiara: filamenti sottili 26

Chinesina (microtubuli) proteina motrice identificata nell’assone gigante di seppia composta da 2 catene pesanti e 2 leggere (2 domini motori globulari e un coiled-coil allungato responsabile della dimerizzazione) Motore N-terminale; movimento in direzione + KRP coinvolta nel trasporto anterogrado (trasporto assonale veloce) di molecole (RE), dal corpo cellulare, verso la terminazione dell’assone

Ciclo della Chinesina Chinesina: 50% lega; 50 % non lega il MT durante il ciclo di H-lisi dell’ATP Attacco dell’ATP alla testa della chinesina che lega il MT spinge in avanti la seconda testa (legata all’ADP) La seconda testa lega il MT L’H-lisi dell’ATP su una testa e il distacco del’ADP sull’altra riporta alla conformazione iniziale ma con le teste invertite e con uno spostamento spaziale

Miosina vs chinesina Miosina: Chinesina: passo singolo ma lungo Ciclo rapido Opera come un fascio Chinesina: Passi multipli, ma brevi Ciclo più lento Opera come unità singola 29

Dineine (microtubuli) composte da 2 o 3 catene pesanti (comprendono il dominio motore) e un numero grande e variabile di catene leggere associate si muovono verso l’estremità (-) dei microtubuli coinvolte nel trsaporto retrogrado di molecole (Golgi) o organelli racchiusi in vescicole dalla terminazione, verso il corpo cellulare del neurone DINEINE CITOPLASMATICHE: omodimeri di catene pesanti con 2 grandi domini motori come teste DINEINE ASSONEMALI: eterodimeri ed eterotrimeri con 2 o 3 domini di testa; coinvolte nello spostamento veloce di microtubuli nelle ciglia 30

MODELLO PER L’ATTACCO DI DINEINA AD UN ORGANELLO La dineina richiede l’associazione con dinactina (complesso proteicoche comprende un filamento simile all’actina che interagisce con complessi proteici presenti sulle membrane degli organelli) per svolgere la sua funzione REGOLAZIONE: fosforilazione, cAMP….

Sono strutture mobili costituite da microtubuli e dineine CIGLIA E FLAGELLI: Sono strutture mobili costituite da microtubuli e dineine strutture mobili altamente specializzate ed efficienti appendici cellulari con un fascio di microtubuli centrale FLAGELLI: Su spermatozoi e in molti protozoi movimento ondulatorio permette alle cellule di nuotare in mezzi liquidi CIGLIA: più corte dei flagelli ma organizzate in modo simile movimento a frusta cicli di ciglia adiacenti sono sincronizzati ma non esattamente (movimento ad onda) muovono singole cellule in un fluido o muovono un fluido sulla superficie di un gruppo di cellule in un tessuto (vd. Apparato respiratorio) 32

Movimento di ciglia e flagelli: Forza perpendicolare all’asse dell’assonema Disposizione dei MT a “9+2” nell’assonema di ciglia e flagelli 33

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FLAGELLI BATTERICI: Flagellina Rotazione ad elica CORPI BASALI: strutture che radicano ciglia e flagelli alla Superficie cellulare. Composti da 9 gruppi di triplette di Microtubuli fusi FLAGELLI BATTERICI: Flagellina Rotazione ad elica 35

MOVIMENTO CELLULARE: POLARIZZAZIONE DI CELLULE DI LIEVITO: coinvolge l’ACTINA durante la gemmazione e i MICROTUBULI nella polarizzazione morfologica (risposta a fattori di accoppiamento) 36

Sviluppo, embriogenesi, neuroni CELLULE CHE STRISCIANO SU UN SUBSTRATO SOLIDO : processo integrato e complesso che dipende dalla corteccia cellulare ricca di actina; coinvolte 3 attività. PROTRUSIONE Filipodi: 1D Lemellipodi: 2D Pseudopodi: 3D ATTACCO: TRAZIONE: Sviluppo, embriogenesi, neuroni Animale adulto, risp immunitaria, osteoblasti, fibroblast (connettivo) Patologie, tumori 37

Lamellipodi e increspature Fibroblasti in coltura su un foglio di gomma al silicone 38

Organizzazione dei microtubuli in fibroblasti e neuroni 39

Cono di crescita dei neuroni 40

MATRICE EXTRACELLULARE insieme di proteine e polisaccaridi, secrete da diversi tipi di cellule, che costituiscono strutture extracellulari in grado di svolgere diverse funzioni diversa concentrazione delle diverse componenti della matrice dà origine a strutture molto diverse tra loro (es, tendini, cartilagini dell’osso…) funzione principale di sostegno altre funzioni di regolazione della divisione cellulare, adesione, motilità e migrazione cellulare (distruzione controllata della matrice ad opera di proteasi), differenziamento durante l’embriogenesi le funzioni diverse dipendono dalle sostanze che la compongono e dalla loro particolare disposizione 41

Le cellule che producono le molecole della matrice sono essenzialmente fibroblasti ; In certi tipi specializzati di tessuti connettivi (cartilagine e osso) tali molecole sono secrete da cellule della famiglia dei fibroblasti più specializzate (es, condroblasti e osteoblasti) 42

Due classi principali di macromolecole extracellulari compongono la matrice extracellulare: - catene polisaccaridiche della classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si trovano di solito uniti covalentemente a proteine sotto forma di proteoglicani - proteine fibrose, fra cui collagene, elastina, fibronectina e laminina che hanno funzioni sia strutturali che adesive. Le molecole di proteoglicano nel tessuto connettivo formano una “sostanza basale” simile a gel altamente idratata in cui le proteine fibrose sono immerse. Le fibre di collagene rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice e fibre di elastina simili a gomma le danno elasticità. 43

GLICOSAMMINOGLICANI: Sono catene polisaccaridiche non ramificate composte da unità ripetute di disaccaridi. Uno degli zuccheri è sempre uno zucchero amminico (nella maggior parte dei casi è solfato). Il secondo zucchero è di solito un acido uronico (glucuronico o iduronico) 44

PROTEOGLICANI: Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule animali. La catena polipeptidica, o nucleo proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e introdotta nel lume. Le catene polisaccaridiche sono assemblate su questo nucleo principalmente nell’apparato del Golgi. Qui vengono anche aggiunti gli zuccheri. 45

COLLAGENI: Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule del tessuto connettivo e da una varietà di altri tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti nei mammiferi (costituiscono pelle ed osso). Danno origine a fibre semicristalline che tengono in posizione le cellule, conferiscono resistenza alla tensione ed elasticità alla matrice; svolgono funzioni importanti nell’ambito della mobilità e dello sviluppo delle cellule. Glicoproteine per lo più insolubili, caratterizzate da un contenuto elevato di Gly e di 2 aa modificati: idrossi-Lys e idrossi-Pro. 46

Singole molecole di collagene sono strutture lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le singole catene, dette catene a, si avvolgono a formare un’elica sinistrorsa a passo lungo. I residui di Pro, a spaziatura regolare, sono importanti per la stabilizzazione di questa struttura elicoidale. 3 catene a si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa, relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all spaziatura regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica è responsabile della natura fibrosa . A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua, o può contenere regioni che danno origine a strutture a conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da regioni cardine e danno maggiore flessibilità. 47

FIBRE ELASTICHE: Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre di collagene. Componente principale è l’ELASTINA (proteina altamente idrofobica, ricca di Pro e Gly, non glicosilata). L’elastina è prodotta a partire da un precursore (TROPOELASTINA) solubile secreto nello spazio extracellulare ed è assemblata in fibre vicino alla membrana plasmatica. Segue la formazione di legami crociati che permette la formazione di una rete. 48

FIBRONETTINA: Grossa glicoproteina, dimero composto da 2 subunità molto grandi unite da legami disolfuro ad una estremità. Ciascuna subunità è ripiegata in una serie di domini funzionali distinti separati da regioni di catena polipeptidica flessibile. Può dare fibrille. 49

LAMINE BASALI: Sottili tappeti flessibili di matrice specializzata, sottostanti ai fogli e tubi di cellule epiteliali. Funzione di separazione e filtro (glomerulo); determinano la polarità cellulare , influenzano il metabolismo. Sintetizzata in gran parte dalle cellule che si trovano su di essa; fibrille di ancoraggio composte soprattutto da collagene di tipo IV. Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione (giunzione neuromuscolare). 50

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GIUNZIONI CELLULARI: TESSUTO CONNETTIVO: TESSUTO EPITELIALE: Matrice extracellulare abbondante e cellule distribuite in modo sparso al suo interno; è la matrice che sopporta lo stress meccanico. Gli attacchi diretti tra una cellula e l’altra sono rari. TESSUTO EPITELIALE: Cellule unite strettamente in foglietti chiamati epiteli: matrice extracellulare scarsa, consiste di un tappeto sottile (lamina basale) che sta sotto l’epitelio. L’adesione cellula-cellula sopporta la maggior parte degli stress meccanici. (IMP: contatto tra citoscheletro di cellule adiacenti) 52

classificazione funzionale delle giunzioni GIUNZIONI CELLULARI: Giunzioni specializzate, si trovano nei punti di contatto cellula-cellula e cellula-matrice. Classificate in 3 gruppi funzionali: 1) g. occludenti: saldano insieme le cellule di un epitelio impedendo il filtraggio di molecole da una parte all’altra dell’epitelio. 2) g. di ancoraggio: attaccano meccanicamente le cellule alle loro vicine o alla matrice. 3) g. comunicanti: mediano il passaggio di segnali chimici o elettrici da una cellula all’altra. classificazione funzionale delle giunzioni g. occludenti g. strette g. Settate (invertebrati) g. di ancoraggio g. cellula-cellula g. cellula-matrice g. comunicanti g. gap sinapsi chimiche plasmodesmosomi 53

g. occludenti: g. strette: Permettono agli epiteli di servire da superficie di separazione, non permettono il passaggio di molecole. rete ramificata di filamenti sigillanti che contornano l’estremità apicale di ciascuna cellula del foglietto epiteliale ciascun filamento è composto da una lunga fila di proteine di adesione transmembrana immerse in entrambe le membrane; i domini extracellulari si uniscono tra loro per occludere 54

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Proteine principali: CLAUDINE (di diverso tipo, presenti diversamente nelle giunzioni strette) e OCCLUDINE (funzione incerta, si associano con proteine periferiche intracellulari di membrana chiamate PROTEINE ZO -zona occludens- che ancorano i filamenti al citoscheletro di actina) 56

g. di ancoraggio: Forte struttura che attraversa la membrana ed è attaccata al citoscheletro. Composte da 2 classi principali di proteine: proteinedi ancoraggio intracellulare (formano una placca sulla superficie citoplasmatica della membrana e connettono il complesso giunzionale o ai filamenti di actina o a filamenti intermedi) proteine di adesione transmembrana (coda citoplasmatica che si attacca a una o + proteine di ancoraggio intracellulari e a un dominio extracellulare che interagisce con domini extracellulari di proteine di adesione transmembrana specifiche su un’altra cellula). Molte giunzioni contengono proteine di segnalazione intracellulare che rendono le giunzioni capaci di segnalare all’interno della cellula. 57

g. aderenti: caderine + catenine Le giunzioni aderenti esistono in 2 forme funzionalmente diverse: g. aderenti: caderine + catenine Esistono in varie forme e sono presenti in molti tessuti non epiteliali punti di attacco tondeggianti o a striscia che connettono ndirettamente i filamenti di actina corticali di 2 cellule interagenti formano una “cintura di adesione” sotto le giunzioni strette morfogenesi un fascio contrattile di filamenti di actina si trova adiacente alla cintura orientato in senso parallelo alla membrana (legame actina-membrana tramite proteine come CATENINE, VINCULINA, a-ACTININA) 58

desmosomi: punti di contatto intracellulare a forma di bottone che ancorano le cellule le une alle altre. Siti di ancoraggio per filamenti intermedi che formano una impalcatura strutturale resistente alla tensione Placca citoplasmatica composta da PLAKOGLOBINA e DESMOPLAKINA, DESMOGLEINA e DESMOCOLLINA. 59

Adesioni focali: giunzioni cellula-matrice basate su INTEGRINE. rendono le cellule in grado di fare presa sulla matrice (integrine si legano all’interno della cellula a filamenti di actina) 60

emidesmosomi: si connettono a filamenti intermedi connettono la cellula a una lamina basale (LAMININA) domini extracellulari legano la lamina basale, quelli intracellulari legano i filamenti di cheratina tramite la PLECTINA. 61

g. comunicanti: g. gap: costituite da proteine che formano canali (CONNESSINE); i canali formati (CONNESSONI) permettono il passaggio di ioni inorganici e altre piccole molecole solubili in acqua di passare da una cellula all’altra. Le giunzioni gap di tessuti diversi possono aver diverse proprietà (esistono connessine diverse). Sincronizzazione segnali elettrici (contrazione muscolare) Liberazione glucosio (segnale da epatociti innervati a epatociti non innervati) Possono essere regolate (pH, Ca2+) protezione del passaggio di segnali nocivi da una cellula a quelle adiacenti Ex: danno alla membrana, passaggio di ioni all’interno, gli ioni non devono diffondere alle cell vicine, chiusura delle giunzioni gap 62

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ADESIONI CELLULA-CELLULA: La motilità cellulare e l’adesione si combinano per far avvenire diversi processi morfogenetici; questi processi possono richiedere un meccanismo che diriga le cellule alla loro destinazione finale (CHEMOTASSI, CHEMOREPULSIONE, o GUIDA DELLA VIA). Una volta che la cellula migrante ha raggiunto la sua destinazione, deve riconoscere altre cellule del tipo appropriato e unirsi a loro per assemblarsi in un tessuto. Le cellule aderiscono tra loro e alla matrice extracellulare tramite proteine di superficie cellulare chiamate MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE (CAM), che possono o meno essere dipendenti dal calcio. 64

caderine: CAM principale, calcio dipendente. superfamiglia di proteine che comprende caderine classiche e non la maggior parte sono proteine transmembrana a singolo passaggio, possono formare dimeri e oligomeri, a livello extracellulare 5 o 6 ripiegamenti Ig simili 65

mediano legame OMOFILICO sono unite al citoscheletro di actina da CATENINE (proteine di ancoraggio intracellulari) Fondamentali nel direzionare la morfogenesi, comparsa e scomparsa di alcuni tipi mediano lo sviluppo dell’embrione 66

selettine: proteine di superficie che legano carboidrati (LETTINE) che mediano una varietà di interazioni transitorie di adesione nel torrente circolatorio, che dipendono dal calcio 3 tipi: L-, P-, E-selettina (linfociti, piastrine, endotelio) proteine transmembrana con dominio di lettina altamente conservato ruolo importante nell’attaccodei globuli bianchi alle cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni mediano un’adesone debole (rotolamento) Espressione: richiamo vs zone di infiammazione 67

Super famiglia delle Immunoglobuline: Adesione Ca2+ indipendente N-CAM Derivano da splicing alternativo di un singolo gene Segnali intracell (vd. Src e fosforilazione) Legano lunghe catene di acido sialico Forte carica – Adesione debole Ruolo nella segregazione cellulare 68

integrine: Ca2+/Mg2+ dip recettori transmembrana principali sulle cellule animali per il legame con la maggior parte delle proteine della matrice extracellulare eterodimeri transmembrana (a e b) fanno da collegamento tra matrice e citoscheletro connesse a fasci di filamenti di actina tramite subunità b e reclutamento di TALINA, a-ACTININA, FILAMINA attività può essere modulata e può attivare vie del segnale 69

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TECNICHE PER LO STUDIO DI ADESIONE E MIGRAZIONE: Test di aggregazione: Cellule in aggregato in coltura + cellule libere: si valuta l’aggregazione (cellule di retina VS cellule di fegato) CAMPENOT CHAMBER: Test per valutare l’adesione e il differenziamento cellulare. PROTOCOLLO: Una petri viene coattata con collagene si scavano dei solchi con un pin-rake si posiziona una goccia di medium sui solchi si silicona la campenot e la si fa aderire sulla pertri (con le fessure perpendicolari ai solchi) si mette un po’ di medium nelle fessure laterali della campenot e si lascia in incubatore per 1 ora si piastrano le cellule e si mettono a contatto con i fattori stimolanti. 71

MATRIGEL MATRIX: Il matrigel è una membrana basale solubile derivante da estratti di sarcoma, indotto in topi EHS,tumore che produce tipicamente molte proteine della matrice extracellulare. Contiene principalmente: LAMININA, COLLAGENE IV, PROTEOGLICANI SOLFORATI, FATTORI DI CRESCITA. PROTOCOLLO: preperazione di aggregati cellulari utilizzando una pipetta prerafreddata si posizionano gocce di matrigel su una piastra e si incubano a 37gradi (il matrigel gelifica) si seminano sul matrigel gelificato gli aggregati cellulari che vengono coperti con un’altra goccia di matrigel (incubazione a 37gradi) aggiunta di medium con diversi trattamenti e fattori chemiotattici. 72

Analogamente si procede in test di aggregazione su collagene 73

SOFT AGAR ASSAY: Base Agar collagene 1. Melt 1% Agar in microwave. Warm 2X DMEM/F12 + additives. 2. Mix equal volumes of the two solutions. 3. Add 1.5ml/ Petri dish, allow to set.   Top Agar 1.  Melt 0.7% Agar in microwave. Also warm 2X DMEM/F12 + additives to the same temperature. 2. Trypsinize cells and count. 3.  Add 0.1ml of cell suspension to 10ml centrifuge tubes. 5. Label 35mm Petri dishes with base agar appropriately 6. For plating add 3ml 2X DMEM/F12 +Additives and 3ml 0.7% Agar to a tube, mix gently and add 1.5ml to each replicate plate   7. Incubate assay at 37°C in humidified incubator for 10 - 14 days. 8. Stain plates with 0.5ml of 0.005% Crystal Violet for >1 hour, count colonies using a dissecting microscope. 74

camera di migrazione di BOYDEN 75

tests di microchemiotassi e camera di migrazione di BOYDEN colture cellulari dispersione sospensione unicellulare semina membrana pozzetti contenenti il fattore chemiotattico semina migrazione 5 ore colorazione analisi dei risultati 76