Considerazione strategiche 1. Scelta del vettore 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate

2. Scelta del sistema cellulare 1. Facilità di coltura e stabilità 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

Considerazione strategiche 1. Scelta del vettore 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate

3. Scelta della tecnica di transfezione Microiniezione Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Coprecipitazione con calcio fosfato Lipofezione Elettroporazione Infezione con vettori virali

Microiniezione Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo) Impossibile applicazione su larga scala Grande manualità dell’operatore Applicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)

Microiniezione

Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Formazione di aggregati di DNA (-) e DEAE-destrano (+) Deposizione sulla membrana cellulare DNA-DEAE Destrano-TBS Internalizzazione per endocitosi Scarsa efficienza Elevata degradazione del DNA, scarsa penetrazione nel nucleo Utilizzato in cellule con elevata attività endocitotica

Coprecipitazione con calcio fosfato La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-DNA sulla superficie cellulare favorisce l’internalizzazione dell’acido nucleico DNA+CaCl2 HEPES Coprecipitazione Buona efficienza (5-40%) Semplice esecuzione Piuttosto riproducibile Tossicità cellulare

Trasferimento di DNA mediato da liposomi Lipofezione Trasferimento di DNA mediato da liposomi In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA DNA La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol Buona efficienza Scarsa citotossicità Riproducibilità

Lipofezione con reagenti lipidici neutri I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che possono essere riempite con DNA. Esse fondono spontaneamente con le membrane cellulari rilasciando il loro contenuto nel citoplasma. Sono disponibile commercialmente dei kit per la semplice preparazione dei liposomi.

Lipofezione con reagenti lipidici cationici Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400nm) liposomi unilamellari. La superficie carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi. L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi. CELLFECTINTM LIPOFECTAMINETM OLIGOFECTAMINETM

Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati. Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula. Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione del vettore.

Minore esposizione alle nucleasi Elettroporazione Un campo elettrico altera la permeabilità di membrana e permette l’ingresso al DNA. Minore esposizione alle nucleasi Buona efficienza Non c’è endocitosi Elevata citotossicità Adatto a cellule con membrane particolarmente resistenti Adatta a cellule in sospensione

Elettroporazione Le cellule vengono concentrate, miscelate con il DNA da transfettare e collocate in una cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre in maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono piastrate in terreno fresco.

Infezione con vettori virali I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica Infezione Iniezione del DNA Replicazione Sintesi del capside Assemblaggio Lisi

Il genoma virale deve essere modificato Inserimento del gene di interesse Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus “helper” oppure “packaging cell lines”.

Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo. Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la RNA pol T7. Vettori virali SV40. Il primo. Genoma piccolo ed instabile, solo per cellule di scimmia Retrovirus. Genoma ad RNA. Integrazione del vettore. Alta efficienza e capacità. Terapia genica Baculovirus. Virus degli insetti. Porta all’espressione ed accumulo di grandi quantità di proteine. Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la RNA pol T7.

Considerazione strategiche 1. Scelta del vettore 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate

Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.

Marcatori di selezione per cellule di mammifero Tk fosforila la timidina Aminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Timidina chinasi (Tk) XGPRT sintetizza GMP Acido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Inattiva Xyl-A 9-b-D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Adenosina deaminasi (ADA) HPH inattiva igromicina Igromicina B (Inibitore sintesi proteica) Igromicina fosfotransferasi (HPH) Variante resistente DHFR Metotrexate (Inibisce DHFR) Diidrofolato reduttasi (DHFR) APH inattiva G418 G418 (Inibitore sintesi proteica) Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) MECCANISMO FARMACO ENZIMA

Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile 5-fosforibosil-1-pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007) Structure of TFMPV-E2/ER ligand-binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron density map, contoured to 1.5 . ER , oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

L’esempio della identificazione di Nip-2 e protimosina

associates to cell death bnip-2 expression associates to cell death 7 16 h 24h 48h 6 5 4 Cell death (dead cells/dish)x 10 2 3 5 10 15 20 1 4 16 24 48 nip2 mRNA Hours after Locke 2 1 c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5 Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis Meda et al. 2001

BNIP2 CTRL TRANSFECTION OF bnip2 cDNA IN MCF-7 CELLS 100 75 %survival 50 25 200 150 %survival % proliferation Meda et al. 2001

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex +1 -20 -40 -60 -80 -100 GC CCAAT TATA + - Generazione di mutanti + - Analisi di Northern Trascrizione in oociti di Xenopus laevis

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter Elementi di regolazione trans X Proteina facilmente dosabile Z Y Promotore Gene reporter Elementi di regolazione cis Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici

I geni reporter Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa l di fluorescenza. Green fluorescent protein (GFP, varianti RFP, BFP) Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. Fosfatasi alcalina (Umana) Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP. Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Luciferasi (Lucciola) Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Ben caratterizzata, stabile, rilevazione automatizzabile B-Galattosidasi (Batterica) SVANTAGGI VANTAGGI GENE

Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA ERE LUC Potenziali ligandi LUC ER LUC Units CTR E2 CTR

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. b-Galattosidasi e Luciferasi

High-throughput Screening (1) Elaborazione digitale dei dati La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”. Elaborazione digitale dei dati Library di molecole Saggio biologico automatizzabile Piattaforma Robotizzata

High-throughput Screening (2) 1990. 20 ricercatori 1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori 2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA’ della sostanza testata.

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati.

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione CONTROLLO QUALITA’ Caratterizzazione del prodotto

Controllo di qualità di proteine terapeutiche Composizione in acido sialico Composizione in carboidrati Sequenziamento N-terminale Mappa peptidica HPLC Isoelectrofocusing SDS PAGE Western Saggio immunologico Saggio biologico Caratterizzazione della proteina Spettrometria di massa Presenza di DNA cellulare Presenza pirogeni Presenza di proteine cellulari Presenza di proteine seriche HPLC SDS PAGE/Western Determinazione dello stato di purezza

Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) TPA ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per l’uomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette

Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio BHK (Baby Hamster Kidney cells) Fattore VII CHO Glucocerebrosidasi Eritropoietina Interferone beta FSH E.Coli G-CSF IL-2 hGH Interferone alfa Insulina E.Coli, CHO TPA