LEZIONE 9 Ingegneria cellulare II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 Adriana Maggi

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

REPORTERS Biological reporter: molecules acting as surrogate, measurable, indicators of a given molecular event

I geni reporter Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa l di fluorescenza. fluorescent proteins (GFP, varianti RFP, BFP) Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. Fosfatasi alcalina (Umana) Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP. Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Luciferasi (Lucciola) Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Ben caratterizzata, stabile, rilevazione automatizzabile B-Galattosidasi (Batterica) SVANTAGGI VANTAGGI GENE

fluorescent proteins La green fluorescent protein è una proteina naturale (prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo dell’ultravioletto (l 395 nm), ma anche del visibile (l 475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm) Osamu Shimomura Premio Nobel 2008

Fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly che è ciclizzato: p-idrossibenzilidene-imidazolidone

Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un intermediato (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di ossidazione della Tyr66. La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto stabile.

La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza , segmenti ad alfa elica chiudono I cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare struttura con fogietti beta esterni e alfa eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente degradabile.

Roger Tsien, premio Nobel 2008 La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm. Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, ecc) Roger Tsien, premio Nobel 2008

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP

Luciferasi Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato specifico causano la produzione ( luciferasi di lucciola, e suoi derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre). luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni

Utilizzo di proteine bioluminescenti o fluorescenti per studi di funzione geniche, di correlazioni-struttura-funzione, studi di regolazione di espressione genica

Prodotto genico facilmente Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter Elementi di regolazione trans X Prodotto genico facilmente quantizzabile Z Y Promotore Gene reporter Elementi di regolazione cis

Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale del recettore degli estrogeni * ** endo wt 1-399 182-599 S122A C241/244A G525R L543/544A 1 2 3 4 aa 1 mM ER activity (fold over basal) A AF-1 DBD AF-2 D F -COOH :wt :1-399 :182-599 :S122-A :C241/244-A :G525-R :L543/544-A NH - S236A

Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex +1 -20 -40 -60 -80 -100 GC CCAAT TATA + - Generazione di mutanti + - Analisi di Northern Trascrizione in oociti di Xenopus laevis

Studio di funzione genica: l’esempio della identificazione della funzione di Nip-2 e protimosina

associates to cell death bnip-2 expression associates to cell death 7 16 h 24h 48h 6 5 4 Cell death (dead cells/dish)x 10 2 3 5 10 15 20 1 4 16 24 48 nip2 mRNA Hours after Locke 2 1 c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5 Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis Meda et al. 2001

TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA IN MCF-7 CELLS CTRL BNIP2 100 75 50 25 200 150 %survival % proliferation apoptosi proliferazione

STUDI DI STRUTTURA-FUNZIONE

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007) Structure of TFMPV-E2/ER ligand-binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron density map, contoured to 1.5 . ER , oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA ERE LUC Potenziali ligandi LUC ER LUC Units CTR E2 CTR

High-throughput Screening (1) Elaborazione digitale dei dati La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”. Elaborazione digitale dei dati Library di molecole Saggio biologico automatizzabile Piattaforma Robotizzata

High-throughput Screening (2) 1990. 20 ricercatori 1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori 2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA’ della sostanza testata.

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati.

IMPIANTO DI FERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione CONTROLLO QUALITA’ Caratterizzazione del prodotto

Controllo di qualità di proteine terapeutiche Composizione in acido sialico Composizione in carboidrati Sequenziamento N-terminale Mappa peptidica HPLC Isoelectrofocusing SDS PAGE Western Saggio immunologico Saggio biologico Caratterizzazione della proteina Spettrometria di massa Presenza di DNA cellulare Presenza pirogeni Presenza di proteine cellulari Presenza di proteine seriche HPLC SDS PAGE/Western Determinazione dello stato di purezza

Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) TPA ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per l’uomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette

Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio BHK (Baby Hamster Kidney cells) Fattore VII CHO Glucocerebrosidasi Eritropoietina Interferone beta FSH E.Coli G-CSF IL-2 hGH Interferone alfa Insulina E.Coli, CHO TPA