CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 LEZIONE 8 Ingegneria cellulare CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 Adriana Maggi

integrazione di DNA esogeno Ingegneria Cellulare Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o integrazione di DNA esogeno

Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla farmacologia Identificazione di bersagli di farmaci Screening di farmaci Produzione di proteine terapeutiche Terapia cellulare

considerazioni preliminari Ingegneria cellulare considerazioni preliminari 1. Gene/processo di interesse 2. Tipo di cellula da transfettare 3. Scelta del vettore 4. Modalità di transfezione/infezione 5. Applicazioni

Ingegneria cellulare: i diversi passaggi 1. Identificazione del gene di interesse 2. Scelta della metodologia adeguata 3. Messa a punto del vettore per la mutagenesi genomica o per la veicolazione nella cellula del gene di interesse 4. Inserimento del vettore nella cellula bersaglio (transfezione o infezione) 5. Identificazione delle cellule ingegnerizzate

La scelta del sistema cellulare 1. coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

Scelta del sistema cellulare 2. 1. Facilità di coltura e stabilità 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

1. La scelta del vettore Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare: 1. iperespressione proteica 2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo 3. studio della regolazione della espressione di un gene

Vettori per ingegneria cellulare sequenze per la replicazione in procariote Cassetta di espressione Polylinker Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.) Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing ) Marcatori di selezione

Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore virale Introne chimerico Polylinker Poliadenilazione Promotore T7 pol Promotore T3 pol Origine di replicazione del fago f1 Neo resistenza Amp resistenza E.Coli ori

T-antigen e cellule COS. L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di espressione di proteine esogene senza l’utilizzo di promotori virali forti. Il gene è clonato in un plasmide che include l’origine di replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel loro genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che riconosce l’origine di replicazione di SV40 e stimola una massiccia replicazione del plasmide.

Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. Coli è possibile regolare l’espressione di un transgene. Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico) Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE

Il sistema Tet-on/Tet-off E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina. pCMV tetR VP16 Tet-OFF Plasmidi codificanti per l’elemento di regolazione pCMV rtetR VP16 Tet-ON TRE Pmin CV Gene of interest Transcription Plasmide contenente il transgene

basato sulla produzione della proteina transattivante tTA Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

Integrazione di DNA esogeno nel genoma cellulare Gene trapping ( integrazione casuale) Gene targeting (integrazione sito-specifica)

La ricombinazione omologa è il processo alla base della integrazione sito specifica Es. di gene targeting

GENE knock-out; GENE Knock-in Integrazione sito specifica DNA target Gene targeting vector Integrazione random

C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23 Ganciclovir, un analogo di nucleosidi che puo’ essere fosforilato ad un tripfosfato analogo da parte dell’enzima timidina cinasi di Herpes simplex e quindi integrato nel DNA.

Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile 5-fosforibosil-1-pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina

3. Modalità di trasfezione Transfezione transiente o stabile Tecnologia per la transfezione

Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.

Marcatori di selezione per cellule di mammifero Tk fosforila la timidina Aminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Timidina chinasi (Tk) XGPRT sintetizza GMP Acido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Inattiva Xyl-A 9-b-D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Adenosina deaminasi (ADA) HPH inattiva igromicina Igromicina B (Inibitore sintesi proteica) Igromicina fosfotransferasi (HPH) Variante resistente DHFR Metotrexate (Inibisce DHFR) Diidrofolato reduttasi (DHFR) APH inattiva G418 G418 (Inibitore sintesi proteica) Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) MECCANISMO FARMACO ENZIMA

Transfezione stabile - applicazioni Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive. Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate

Transfezione transiente - applicazione Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori Studi di correlazione struttura attività di mutanti