Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

L’IMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI CON L’APPLICAZIONE DI SISTEMI REPORTER

SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE RIPRODUCONO FEDELMENTE L’EVENTO MOLECOLARE IN STUDIO Tra i reporter più utilizzati: cloramfenicolo acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta galattosidasi, beta-glucuronidasi, luciferasi, proteina verde fluorescente Atr i reporter più uilizzati:

β-galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu β-glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su substrati incolori quali: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di colore blu 4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto fluorescente Cloramfenicolo acetiltransferasi: un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetil-COA (radioattivo) al cloramfenicolo

GENE ADVANTAGES DISADVANTAGES B-Galattosidase (Bacateria) Well characterized, stable, low cost substrate, detectable by automtized systems Presence of endogenous activity in mammalian cells, tetrameric enzymes- non linear response Luciferase (insect) High specific activity, very low background) Detection needs the cofactor O2, ATP. Substrate quite expensive Fosfatase (human) Secreted protein, enzymatic assay extremely sensitive. Very high background in selected cell types Green fluorescent protein (GFP, and variants RFP, BFP) Monomeric, no substrate required, not expressed in mammalian, variants with different l of emission Low sensitivity in the absence of enhancer (this is not an enzymatic reaction)

Reporter bioluminescenti e fluorescenti

Tipiche molecole reporter per imaging sono: Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others), proteine strutturalmente omologhe contenenti sequenze di tre aa in grado di funzionare da cromoforo Molecole bioluminescenti (fotoproteine e luciferasi) proteine che diventano/emettono particelle luminose in prsenza di specifici cofattori o substrati

Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria) Una proteina composta da 238 aa la cui struttura spaziale determina la formazione di una struttura a forma di “lattina di birra” al cui interno risiede il cromoforo (un tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ). L’emissione è a l= 504 nm)

Natural Fluorescent proteins The Zoanthus yellow fluorescent protein chromophore Discosoma red fluorescent protein chromophore Anemonia sulcata "kindling" fluorescent protein Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red fluorescent protein chromophore

Synthetic Fluorescent proteins

La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi: luciferin + ATP → luciferyl adenylate + Ppi luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + light

Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione di Co2 e bioluminescenza

Proteina facilmente dosabile I sistemi reporter nello studio della regolazione dell’espressione genica Elementi di regolazione trans X Proteina facilmente dosabile Z Y Promotore Gene reporter Elementi di regolazione cis Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici

Identificazione di molecole attive su fattori di trascrizione. ER cDNA ERE LUC Potenziali ligandi LUC ER LUC Units CTR E2 CTR

I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale

I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine

GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER Ingegneria Cellulare Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante l’inserimento di DNA esogeno

La scelta del sistema cellulare coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

Scelta della tecnica di transfezione Microiniezione Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Coprecipitazione con calcio fosfato Lipofezione Elettroporazione Infezione con vettori virali

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP