Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica ed elettronica

Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M) OCULARE OBBIETTIVI TAVOLINO PORTA CAMPIONE CONDENSATORE DIAFRAMMA DI CAMPO LAMPADA CANNONE ELETTRONICO PORTA CAMPIONE CONDENSATORE OBBIETTIVO SCHERMO FLUORESCENTE CAMERA FOTOGRAFICA Cercare foto vere di m.o. e TEM Il cannone elettronico genera il fascio di elettroni che vengono accelerati con una ddp di 40-120 KV Schermo fluorescente:costit da sost fluorescente che se eccitata da elettroni ad 1 certa λ emette luce con λ nel visibile Condensatore:dirige un fascio conico di elettroni sul campione Obiettivo:

Aumentando la risoluzione aumentano proporzionalmente anche gli artefatti e la loro visibilità 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano Microscopio ottico Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione

Problematiche… la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi la maggioranza dei tessuti biologici sono molli prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione Inclusione Congelamento i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

Prelievo • Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare • Deve essere eseguito da materiale biologico vivente • Deve essere eseguito il più velocemente possibile • Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica

Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

La Fissazione FISICA CHIMICA Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking) FISICA Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse: Congelamento in N2 o -30°C Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino CHIMICA Uso di sostanze chimiche: Perfusione Immersione Con vapori

LE ALDEIDI La fissazione chimica Microscopia Ottica FORMALDEIDE + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4 4 ore 4°C • usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4 • elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h) • agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili) • preserva una buona morfologia PFA 10% + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4 4 ore 4°C Gluta più veloce e stabile perché è 1 dialdeide con 2 siti reattivi 4°C ritarda le attività autolitiche, assicura 1 fix uniforme, previene l’estrazione dovuta all’overfix. PARAFORMALDEIDE • preserva la reattività delle macromolecole • indicata per indagini biochimiche

LE ALDEIDI La fissazione chimica Microscopia Elettronica GLUTARALDEIDE GA 2-4% in Tampone Fosfato pH 7.4 2-4 ore 4°C • penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide • forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide • non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane Post-fissazione con Osmio Tetrossido OsO4 1-2% In Tampone Fosfato pH 7.4 2 ore 4°C buio • Fissa i lipidi insaturi Colora le membrane riducendosi ad ossido di osmio • agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2° • reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione

I Tamponi PBS Tampone fosfato di Sorensen Tampone Cacodilato I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversità di pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di osmolarità Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore) PBS Tampone fosfato di Sorensen Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M Tampone Cacodilato Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico

Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

La Disidratazione Chiarificazione Infiltrazione Alcool 70% Alcool 90% E’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con un solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine) La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni Alcool 70% Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70% (T.E.M.) Alcool 90% Alcool 100% Chiarificazione L’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione Xilolo Paraffina Ac.uranile contrasta gli ac.nucleici Una cattiva disidratazione riduce la polimerizzazione delle resine e ne impedisce la penetrazione perfetta nel campione Acetone assoluto Resine idrofobiche per T.E.M. Ossido di propilene Infiltrazione Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione) 3:1 2:1 1.1 1:2 1:3

Fasi della preparazione Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione

Inclusione PARAFFINA (M.O.) RESINE (T.E.M.) E’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili PARAFFINA (M.O.) RESINE (T.E.M.) • Miscela di idrocarburi saturi • Epon, Araldite • liquida a T ambiente • solida a T ambiente • polimerizza a 60-70°C • punto di fusione a 54-60° • insolubile in H2O, solubile in acetone • insolubile in H2O, solubile in xilolo • si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione Il campione viene immerso in paraffina o resina pura per completarne l’infiltrazione

Polimerizzazione Resina (T.E.M) Paraffina (m.o.) T ambiente 60-70°C Blocchetti pronti per essere tagliati in sezioni

Il taglio delle sezioni MICROTOMO Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM

La raccolta delle sezioni Vetrini Xilanizzati La colorazione I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O) Metodica ematossilina eosina Ematossilina 10 min Lavaggio con H2O corrente Eosina 1 min Disidratazione Montaggio

Ematossilina: nuclei Eosina: citoplasma eosina ematossilina

COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono NATURALI animali : es. carminio (colorante acido nucleare) vegetali: es. ematossilina (colorante acido) ARTIFICIALI eosina (colorante basico citoplasmatico) ACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma BASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei NEUTRI formati dall’unione di un colorante acido con uno basico fucsina, violetto di genziana (coloranti nucleari)

COLORAZIONI chimiche fisiche chimico fisiche chimiche: reazione tra colorante e substrato COLORAZIONI ISTOCHIMICHE evidenziano molecole come lipidi e zuccheri OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI) o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi o.r.o si deposita al loro posto P.A.S. (PER ZUCCHERI) • acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH degli zuccheri CHOH-CHOH CHO-CHO reagisce con composto fucsina-acido solforoso e da’ colorazione fucsia

substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche Es. impregnazione argentica Sali d’argento + sostanza riducente liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile (fibre nervose) CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro EOSINA EMATOSSILINA

ULTRAMICROTOMO Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell’esame ultrastrutturale al T.E.M.

SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore Lama di diamante Il taglio delle sezioni Raccolta delle sezioni retino

LA COLORAZIONE Acetato di Uranile e Citrato di Piombo il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il contrasto le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O) le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti Acetato di Uranile e Citrato di Piombo

…un esempio di applicazione UVB 1 MED UVB 10 MED semifini fini