Trasformazione Batterica

Prerequisiti Cellula batterica Struttura del DNA Duplicazione del DNA Sintesi proteica Plasmidi Enzimi di restrizione Operoni Amminoacidi e proteine Sostanze idrofile ed idrofobe Interazioni intermolecolari

Tecnologia del DNA ricombinante Insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare frammenti di tale molecola, moltiplicarli, sequenziarli, mutarli e combinarli con materiale genetico proveniente da fonti differenti.

Escherichia Coli non patogeno crescita in terreno minimo alta frequenza replicativa buona conoscenza del suo genoma

Trasformazione Induzione della competenza Inserimento in batteri di materiale genetico tramite l’utilizzo di plasmidi o fagi come vettori di trasformazione. Induzione della competenza CaCl2 rende permeabile la parete cellulare dei batteri (gli ioni Ca++ neutralizzano il DNA carico negativamente e la parete cellulare) Shock termico: ghiaccio 42°C le fenditure si dilatano facilitando l’entrata del plasmide. Il DNA reso precedentemente neutro non viene respinto dalla parete cellulare anzi si avvicina ed entra nella cellula per diffusione

Enzimi di restrizione Tagliano le molecole di acidi nucleici riconoscendo brevi sequenze nucleotidiche a doppio filamento dette siti di restrizione

Ricostruzione della molecola di DNA ricombinante

pGLO( plasmide green like organism) Gene per il metabolismo dell’arabinosio Gene per la sintesi della GFP: proteina che, esposta ai raggi UV, emette una luce verde fluorescente. Questo gene ha, in comune con quello che codifica per l'enzima responsabile del metabolismo dello zucchero arabinosio, un promotore soggetto ad un controllo inducibile Gene per la resistenza all’ampicillina: codifica per la -lactamasi, enzima che rende inattivo l’antibiotico ampicillina, distruggendo l’anello -lattamico delle molecole di tale sostanza

Plasmide

Operone dell’arabinosio Insieme di geni adiacenti, alcuni dei quali sono dei geni strutturali, altri sono dei geni regolatori (operatore e il promotore). L’induttore è l’arabinosio L’arabinosio si lega con il repressore, lo inattiva e avviene l’attivazione della GFP che si illumina se irradiata con UV.

Sezione pratica Per inserire il plasmide ricombinante pGLO nelle cellule batteriche è il seguente: Marcare 2 provette eppendorf con un segno + e con un segno – per renderle distinguibili; la provetta + conterrà batteri con il plasmide ricombinante; la provetta – conterrà batteri senza il plasmide ricombinante. Versare 100 l di soluzione trasformante (TS): (50 mM di CaCl2  crea delle fenditure nella parete cellulare.Tale sostanza rende permeabile la parete cellulare al passaggio dei plasmidi; inoltre, liberando ioni Ca++ , neutralizza le cariche negative del DNA e dei fosfolipidi di membrana favorendo l’entrata della molecola nel citoplasma) Incubare in ghiaccio

Prelevare, servendosi di un’ansa, cellule di E Prelevare, servendosi di un’ansa, cellule di E. coli da una colonia batterica e immetterle nelle due provette Incubare in ghiaccio per alcuni minuti Aggiungere 10 l di una soluzione contenente il plasmide pGLO nella provetta + Incubare in ghiaccio Sottoporre la provetta + ad uno shock termico, esponendola ad una temperatura di 42°C per 50 s; in questo modo si allargano le fenditure create dall’azione del cloruro di calcio; rincubare in ghiaccio perché si richiudano

Aggiungere 10 l di terreno liquido (LB);  Incubare le provette eppendorf a 37°C per 30 min; in questo periodo di tempo il plasmide viene trascritto e tradotto. Successivamente si useranno dei terreni selettivi:

LB LB/Amp LB/Amp/Arabinosio Terreno Cellule batteriche Risultato Minimo Senza plasmide () Con ampicillina Con plasmide (+) Con ampicillina ed arabinosio Crescita cellulare Nessuna crescita Crescita cellulare Crescita cellulare + fluorescenza In presenza di ampicillina soltanto i batteri in cui è stato inserito il pGLO danno origine a colonie, poiché il plasmide contiene il gene per la resistenza all’antibiotico. Inoltre si può notare che l’emissione di luce verde fluorescente avviene solo in presenza dell’arabinosio, poiché tale sostanza è l’induttore del gene che codifica per la GFP.

Colonie di Escherichia coli

LB/Amp LB LB/Amp/Arabinosio L’arabinosio ha indotto la produzione della proteina GFP. Le cellule trasformate hanno espresso nel loro fenotipo i nuovo geni acquisiti dal plasmide pGLO. LB/Amp/Arabinosio

Le colonie dei batteri trasformati, esposte alla radiazione UV, emettono fluorescenza verde

Green fluorescence protein La GFP viene estratta dal reticolo endoplasmatico rugoso e dall’apparato di Golgi della medusa tropicale Aequorea victoria.

Struttura della GFP La GFP è una particolare proteina che, esposta ai raggi UV, emette una luce verde fluorescente. Tale fenomeno è dovuto all’eccitazione degli elettroni più esterni del cromoforo (gruppo insaturo che conferisce alla sostanza organica che lo contiene la capacità di dare colore), situato all’interno della struttura terziaria della proteina. Tale struttura, a forma di cilindro cavo, viene definita a -barile.

In un ambiente acquoso, grazie ai suoi atomi di carbonio la molecola può ruotare e portare la parte esterna verso l’interno e viceversa si adatta all’ambiente. I residui idrofili degli aminoacidi che compongono la GFP sono rivolti verso l’esterno; viceversa, in una soluzione salina molto concentrata, in cui gli ioni presenti attirano le molecole d’acqua e la proteina risulta quindi circondata da un ambiente idrofobo, i residui idrofobi si trovano sul versante esterno del -barile. In ambiente acquoso In soluzione salina

Come selezionare la GFP Sfruttando le caratteristiche chimico-fisiche appena descritte, è possibile separare la GFP dal resto del materiale cellulare e dalle altre proteine per mezzo di una colonna cromatografia ad interazione idrofobica Tale strumento consiste in un tubo di vetro all’interno del quale è presente una resina formata da microscopiche sferette ricoperte da una sostanza idrofoba con caratteristiche affini a quelle della GFP. Trattando la resina con una soluzione salina di concentrazione uguale a quella dell’ambiente in cui è disciolta la proteina, è possibile farla interagire con i residui aminoacidici della GFP; in questo modo la proteina resta legata alla sostanza idrofoba che ricopre le microsfere, mentre le altre macromolecole cellulari sono allontanate mediante un tampone di lavaggio.   Microsferetta

Sezione pratica Aggiungere alla soluzione contenente i batteri 250 l di soluzione TE; la soluzione TE (Tris EDTA  acido etilendiamminotetracetico) è una soluzione salina a bassa concentrazione. In seguito all’aggiunta di tale soluzione cresce la pressione osmotica all’interno della cellula Agitare con il vortex per 10 s al fine di favorire la risospensione delle cellule Aggiungere 10 l di una soluzione contenente la lisozima, enzima che degrada la parete delle cellule batteriche Incubare a 37°C per favorire l’azione dell’enzima; le cellule batteriche, la cui parete è stata degradata lisano a causa della pressione osmotica Centrifugare; in seguito a tale processo la GFP e le altre proteine solubili restano nel surnatante, mentre le macromolecole insolubili precipitano Prelevare 250 l di surnatante e spostarlo in una nuova provetta eppendorf Aggiungere 250 l di soluzione TI; la soluzione TI (ammonio solfato) è una soluzione salina molto concentrata.In seguito all’aggiunta di tale soluzione i residui idrofobi degli aminoacidi della GFP si rivolgono verso l’esterno della molecola;       

Trattare la resina della colonna cromatografica con una soluzione salina di concentrazione uguale a quella della soluzione in cui è disciolta la GFP; in seguito a tale processo i residui aminoacidici della proteina possono legarsi alla sostanza idrofoba che ricopre le microsfere Versare la soluzione contenente la GFP (500 l) nella colonna cromatografica: le macromolecole che presentano affinità per le sostanze idrofobe si separano dalle altre, rimanendo nella resina Versare nella colonna cromatografica 250 l di soluzione TL; la soluzione TL (Tampone di Lavaggio) è una soluzione salina mediamente concentrata. In seguito all’aggiunta di tale soluzione solo la GFP rimane nella resina, mentre le altre macromolecole, che presentano una minore affinità con la sostanza idrofoba, vengono rilasciate; Versare nella colonna cromatografica 250 l di soluzione TE. In seguito all’aggiunta di tale sostanza i residui idrofili degli aminoacidi della GFP si rivolgono verso l’esterno della molecola, che perde ogni affinità con la resina della colonna cromatografica e viene perciò rilasciata; Versare la soluzione che cola dalla colonna cromatografica in diverse provette eppendorf. Esponendo la soluzione ottenuta ai raggi UV, si nota che essa emette una luce verde fluorescente, dovuta appunto alla presenza della GFP.