UNIVERSITA’ DI ROMA “LA SAPIENZA" FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di laurea triennale in scienze biologiche Elaborato finale Ingegnerizzazione di plasmidi per recupero di terre rare tramite ceppi di S. cerevisiae Candidata: Emma Tosti Relatore: Daniela Uccelletti A.A. 2014-2015

Terre rare (REMs) e Lantanio Impiegato nelle industrie, in particolare nella costruzione delle batterie NiMeH • Crisi recupero metalli terre rare: la Cina che ne produce circa il 95%, ne ha ridotto l’esportazione PRINCIPALI TECNICHE DI RECUPERO: •Tecniche tradizionali chimico-fisiche •Tecniche biotecnologiche di bioadsorbimento

Bioadsorbimento Attraverso biomassa (lieviti, alghe e funghi) Basso costo e basso impatto ambientale Legame tra ioni metallici e componenti superficiali molecolari (meccanismo metabolismo-indipendente)

Lievito S. cerevisiae come modello per il bioadsorbimento • Si ottiene facilmente (birra, pane etc…) • Crescita veloce e su terreno poco costoso • Microrganismo GRAS • Geneticamente manipolabile • Genoma interamente sequenziato Modello di parete cellulare di lievito

Scopo STRATEGIA DI CATTURA DEL LANTANIO TRAMITE PARETE CELLULARE DI S. cerevisiae APPROCCIO II APPROCCIO I Mutagenesi e screening ceppo Rim20D Surface display: proteine leganti Ca++ Calmodulina ancorata alla parete tramite GPI di Gas1

Risultati APPROCCIO I • Studio dose-risposta agli UV di ceppo mutante di S. cerevisiae Rim20 D Percentuale di sopravvivenza delle cellule dopo trattamento tramite metodo delle CFU

Risultati • Screening di circa 1500 colonie tramite metodo dell’Alcian Blue: colorante avente proprietà cationiche leganti cariche anioniche sulla parete di lievito ABR (mg/5x107cell) Colonie isolati • 1500 colonie: 12 risultano avere un’aumentata carica negativa sulla parete

Risultati • APPROCCIO II CLONAGGIO CMD-1 IN p426GPD: • Amplificazione per PCR da cDNA stampo di C.elegans PRIMERS M: λ DNA (Pst I) Reverse: sito restrizione EcoRI/3’ di CMD-1 senza codone di stop (C-terminale) Forward: presequenza αfactor/5’ di CMD-1

Risultati • Subclonaggio in pGEM -T Easy • Trasformazione in cellule competenti di E. coli • Recupero DNA plasmidico e digestione con EcoRI (banda evidente a ~ 500 bp) •Estrazione banda da gel d’agarosio Gel pGEM con ultimi 3 cloni positivi (banda a ~500 bp)

Risultati • Ligazione in p426GPD purificato e digerito con EcoRI (con banda evidente a ~ 500 bp) • Trasformazione in cellule competenti di E. coli

Risultati • Recupero DNA e digestione con EcoRI (banda a ~ 500 bp) • Controllo orientamento con SacI-BstXI (banda a ~ 800 bp) Gel p426GPD-CMD-1 con secondo clone positivo con banda a ~ 500 bp Gel p426GPD-CMD-1 con secondo clone positivo per controllo orientamento con banda a ~ 800 bp

Risultati CLONAGGIO GAS1-GPI IN p426GPD-CMD1 • Amplificazione gene GAS1-GPI per PCR da DNA stampo di BY4741 di S. cerevisiae (wt): PRIMERS Forward: sito restrizione HindIII/5’ di GAS1-GPI Controllo gel PCR GAS1-GPI Reverse: sito restrizione XhoI/3’ di GAS1-GPI (N-terminale)

Risultati • Subclonaggio nel pGEM-T Easy • Trasformazione in cellule competenti di E. Coli • Recupero DNA plasmidico digerito con HindIII-XhoI Gel pGEM GAS1-GPI digerito HindIII-XhoI con primo e terzo clone positivo: banda a ~ 400 bp

Risultati • Estrazione banda da gel d’agarosio • Ligazione in p426GPD-CMD1 purificato e digerito HindIII-XhoI • Trasformazione in cellule competenti di E. coli • Successiva analisi dei cloni

Conclusioni e prospettive • Ingegnerizzazione di ceppi di S. cerevisiae per bioadsorbimento del lantanio COSTRUZIONE E OTTENIMENTO PLASMIDE p426GPD-CMD1 • Trasformazione plasmide p426GPD-CMD1 nei ceppi di S. cerevisiae • Analisi con spettroscopia ad assorbimento atomico per la determinazione del Lantanio

Grazie per l’attenzione!