Le applicazioni della terapia genica nelle malattie La terapia genica consente di trasferire la versione funzionante del gene nell’organismo rimediare al difetto uccidere cellule patologiche in cellule malate bloccare il meccanismo alterato che causa la malattia la terapia non è la stessa per tutte le malattie stessi principi metodica differente bersaglio differente fibrosi cistica cellule delle vie aeree immunodeficienze cellule del sangue V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

I limiti della terapia genica La sicurezza della procedura privare i vettori virali della virulenza iniziale Efficienza di trasferimento inserire stabilmente il DNA nelle cellule Selettività del bersaglio esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo cellulare Durata dell’espressione del gene trasferito unico trattamento o ripetuti a distanza di qualche anno La reazione immunitaria evitare che il vettore o il gene estraneo producano una reazione immunitaria V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

Sperimentazioni cliniche in corso Numero e fasi di protocolli di sperimentazione clinica in terapia genica dal 1898 al 2005 materiale genetico introdotto tossicità efficacia espressione a breve/medio termine reale efficacia del trattamento in funzione della cura The Journal of Gene Medicine V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

Bersagli della terapia genica Protocolli di sperimentazione clinica in terapia genica dal 1898 al 2005 per diverse patologie The Journal of Gene Medicine V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni La ricerca immunodeficienza congenita grave (SCID-ADA) immunodeficienze ereditarie malattie lisosomiali diabete di tipo 1 talassemie distrofia muscolare difetti congeniti della pelle ottimizzazione delle procedure di trasferimento genico caratterizzazioni funzionale del gene bersaglio progettazione e realizzazione di nuovi vettori realizzazione di nuovi protocolli per aumentare la efficienza del trasferimento genico caratterizzazione in vivo di cellule trasdotte modulazione di risposte immuni a cellule modificate geneticamente Istituto Telethon-San Raffaele, 2002 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

L'ADA (adenosina deaminasi) L’ADA o adenosina deaminasi è un enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici. La sua carenza provoca effetti sui linfociti T con una grave immunodeficienza. Trattamenti: terapia genica ex-vivo trapianto di midollo osseo sostituzione enzimatica La terapia genica dell'ADA implica: Il clonaggio del gene sano dell'ADA in un vettore retrovirale Il trasferimento del ricombinante ADA nei linfociti T ADA- del paziente L'identificazione dei linfociti diventati ADA+ e la loro espansione in coltura Il reimpianto di queste cellule nel paziente le ricerche sono ora orientate a trasferire il gene dell'ADA nelle cellule staminali del midollo osseo Primo tentativo di terapia genica nel 1990 effettuato da Michael Blaese su una bambina affetta da ADA. Istituto Telethon-San Raffaele, 2002 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

Le strategie molecolari La terapia genica si basa su 4 strategie: Incrementare la dose di un gene deficitario introduzione di copie aggiuntive di quel gene sano(patologie autosomiche) Uccidere in modo mirato le cellule patologiche terapia genica contro il cancro per uccisione delle cellule tumorali diretta geni che codificano per tossina letale (suicida) pro-farmaco indiretta geni immunostimolatori Correggere selettivamente la mutazione che rende il gene non funzionante Inibire selettivamente l'espressione di un gene bloccare il DNA, l'RNA o la proteina della molecola alterata o aberrante espressi dalle cellule malate L. Barberis e M. De Acetis, 2007 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica per le malattie infettive Quali malattie? infezioni che con terapie convenzionali non hanno dato segnali di guarigione malattie protozoarie malaria AIDS Obiettivo: indurre una risposta immunitaria specifica contro le cellule infette la loro uccisione mirata Retrovirus HIV capace di infettare i linfociti T helper (TH) pazienti suscettibili a moltissime altre infezioni Provirus tende a persistere in uno stato latente viene attivato improvvisamente Le cellule infettate dall'HIV possono venire uccise Direttamente con l'inserimento di un gene codificante per un antigene del virus al fine di potenziare la risposta immune nel paziente Indirettamente Interferendo con il ciclo vitale del virus L. Barberis e M. De Acetis, 2007 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica di patologie ereditarie Ipercolesterolemia familiare difetto nell'espressione del recettore delle LDL nel fegato con conseguente affezione prematura delle arterie coronarie Terapia genica effettuata: Parziale epatectomia Estrazione degli epatociti Coltivazione in vitro Trasfezione con recettore per le LDL gene per veicolare resistenza all'igromicina Selezione con l'igromicina Reimmissione nel fegato del paziente mediante iniezione intravena L. Barberis e M. De Acetis, 2007 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni terapia genica di patologie ereditarie Fibrosi cistica: malattia autosomica recessiva determinata da un deficit di trasporto degli ioni cloro attraverso le cellule epiteliali dovuta a mutazioni nel gene CFTR Quadro patologico: distruzione del parenchima polmonare insufficienza pancreatica Terapia genica per trasferire un minigene CFTR utilizza : Adenovirus ricombinante: stabilire prima la massima dose tollerabile Liposomi: più sicuri,ma con efficienza inferiore. V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica dei tumori Obiettivi: riduzione del tumore:in maniera analogo ai trattamenti radioterapici e chemioterapici eliminazione del tumore:per l'uccisione del 100% delle cellule cancerogene Strategie attuabili: trasferimento genico nei linfociti che infiltrano il tumore Immunoterapia adottiva mediante modificazione genetica delle cellule tumorali immunoterapia adottiva mediante modificazione genetica dei fibroblasti L. Barberis e M. De Acetis, 2007 V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica di malattie cerebrali Leucodistrofia metacromatica malattia da accumulo (lisosomiali) si eredita con modalità autosomico recessiva colpisce un bambino su 40mila causata da un difetto nel gene dell’arilsolfatasi A enzima che serve ad evitare l’accumulo di sfingolipidi piccole molecole di grassi presenti nella membrana delle cellule L’accumulo crea danni neurologici nei malati paralisi attacchi epilettici difficoltà respiratorie una singola iniezione di virus modificato è sufficiente a trasferire il gene sano nelle cellule malate, che iniziano a produrre l’enzima mancante il cervello non presenta più traccia del danno da accumulo anche nelle zone più lontane del cervello rispetto al punto in cui viene pratica l’iniezione Per trasferire il gene sano nel cervello degli animali malati HIV privato di tutte le sue componenti pericolose conserva la naturale capacità di trasportare geni in cellule particolarmente refrattarie neuroni sviluppare una strategia di terapia genica per altre patologie del sistema nervoso Alzheimer e Parkinson” V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica contro la cecità «degenerazione ereditaria della retina» patologia progressiva causata da un’alterazione di un singolo gene RPE65 L’intervento: inserire una versione sana del gene nei cromatociti Il gene è stato «trasportato» all’interno dell’occhio da un vettore virale, geneticamente modificato, che lo ha inserito nel DNA delle cellule. per mandare il gene a più cellule possibili, deve essere usata una quantità tale di soluzione da consentire di alzare la retina causandone il temporaneo distacco nel futuro si potrà pensare anche ad altre patologie: degenerazione maculare disturbi ereditari per i quali attualmente non ci sono trattamenti University College di Londra Moorfields Eye Hospital (The Indipendent, 2007) V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica contro l'epilessia Patologia cronica del sistema nervoso caratterizzata da crisi convulsive ricorrenti dovute a un danno cerebrale provocato da cause diverse oppure senza causa organica. Esperimenti su topi hanno dimostrato che: Se i recettori per il GABA di tipo sono attivati,inibiscono : -l’eccessiva e ripetitiva attivazione dei neuroni -squilibrio fra l’attività di due tipi di neurotrasmettitori l’acido glutammico (eccitatorio) il GABA (inibitorio) Se la proteina alpha1 (una sub-unità del recettore) è bassa si manifesta l’epilessia. Strategia: “rifornire” le cellule cerebrali con un ulteriore gene per l’espressione di alpha1 utilizzando come vettore un adenovirus privato del proprio genoma. Risultati: blocco dello sviluppo dell’epilessia dopo una lesione cerebrale modifica del percorso dei segnali nervosi nel cervello Brooks-Kayal (Journal of Neuroscience, 2006) V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

terapia genica in epidermiolisi bollosa EB, malattia genetica della pelle distacco dell’epidermide dal derma La malattia dipende da: undifetto nel gene per la catena beta3 della laminina 5, proteina che permette che l’epidermide si attacchi al derma cellule staminali provenienti dall’epidermide del paziente corrette geneticamente inserimento di un vettore retrovirale della versione sana del gene “malato” fatte crescere in laboratorio fino a ottenere lembi di epidermide trapiantati su due zone delle gambe del malato De Luca (Nature Medicine, 2006) V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni

INDICE DELLE MALATTIE Albinismo oculare tipo 1 Fenilchetonuria Porfirie Anemia falciforme Fibrosi cistica Rene policistico Anomalie cromosomiche Glicogenosi Retinite pigmenosa Atrofia mscolare spinale tipo I II III Immunodeficienze combinate gravi Sclerosi laterale amiotrofica Autismo Ipercolesterolemia familiare Sclerosi tuberosa Cardiomiopatia ipertrofica familiare Malattie lisosomiali Sindrome di Down Cistinuria Malattie mitocondriali Trisomia 13 & 18 Diabete giovanile Morbo di Alzheimer Sindrome di Klinefelter Distrofia Morbo di Parkinson Sindrome X fragile Emofilia Neurofibromatosi tipo 1 Sordità ereditarie Epilessie Osteogenesi imperfetta Talassemia α & β V. Mastrorilli - La terapia genica: le applicazioni