Ruolo del calcio nella contrazione muscolare La prima prova del ruolo fisiologico del Ca2+ nella contrazione muscolare fu fornita da S. Ringer e D.W. Buxton nel 1887, i quali osservarono che eliminando il Ca2+ dalla soluzione, il cuore di rana isolato smette di contrarsi.   Successivamente L.V Heilbrunn e F.J. Wierczinski nel 1943, dimostrarono che fra vari cationi testati solo l’introduzione di calcio nelle fibre muscolari produceva contrazione muscolare in concentrazioni riferibili a quelle fisiologiche; Una prova decisiva fu ottenuta da A.S. Gyorgyl che nel 1947 mise a punto la tecnica di fibre muscolari estratte, in cui le sostanze solubili sono state allontanate (con glicerolo e bassa temperatura), ed osservò che solo in presenza di Ca2+ si verifica la contrazione indotta da ATP.   In seguito si osservò che la relazione tra le concentrazione di Ca2+ e la tensione sviluppata da miofibrille glicerinate era analoga (sigmoidale) a quella osservabile misurando l’attività ATPasica di omogenati di miofibrille.   Ciò fece supporre che il calcio fosse un cofattore dell’attività ATPasica della miosina.     Tale ipotesi si rivelò errata, poiché: 1) purificando gli estratti actomiosinici dalle proteine troponina e tropomiosina associate all’actina, la dipendenza dal Ca2+ per l’attività ATPasica e contrattile spariva; 2) usando agenti chelanti del Ca2+ (EGTA, EDTA) si dimostrò che solo il Mg2+ fosse cofattore necessario all’attività ATPasica.

Ruolo della tropomiosina e del complesso troponina Secondo il modello proposto da S. Ebashi nel 1980 in condizioni di bassa [Ca 2+]in il complesso di troponina (Tn) formato da unità C, T (1, 2) e I, si lega con actina e tropomiosina costringendo quest’ultima a inibire stericamente l’attacco dei ponti trasversi della miosina ai siti dell’actina.   [Ca2+] sarcoplasmatica >10 –7 M consente legame di Ca2+ a TnC, causa cambio conformazionale sub-unità complesso troponina, con conseguente allontanamento della tropomiosina dal sito legante la miosina. L’attività dei ponti trasversi può procedere finchè non viene rimosso il Ca2+ dalla TnC.

Il sistema tubulare sarcoplasmatico Nel 1958 A.F. Huxley e R.E. Taylor stimolando la superficie delle singole fibre muscolari di rana con microelettrodi capillari di vetro osservarono che:   1)      contrazioni locali si manifestavano solo se la punta del capillare è situata in corrispondenza della linea Z; 2)      all’aumentare della corrente stimolante, la contrazione di propaga verso l’interno, ma non in senso longitudinale.

Il sistema tubulare sarcoplasmatico Le fotografie al microscopio elettronico hanno fornito i correlati anatomici a queste scoperte:   1)   intorno al perimetro di ogni miofibrilla decorre un tubulo trasverso (tubulo T) con diametro inferiore a 0,1 m, che si ramifica in modo da risultare continuo con i tubuli che circondano miofibrille vicine; 2)  il sistema di Tubuli T arriva fino alla membrana superficiale, cui è collegato; 3)   è in comunicazione con lo spazio extracellulare come confermato dal fatto che la ferritina e la perossidasi di rafano (molecole proteiche opache agli elettroni) aggiunte al mezzo di incubazione, penetrano nei tubuli T. 4) Interrompendo le connessioni tra tubuli T e membrana superficiale mediante shock osmotico (glicerolo 50% in soluzione), la depolarizzazione della membrana superficiale non era più in grado di stimolare la contrazione muscolare

Accoppiamento depolarizzazione tubuli T e rilascio Ca2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico 1) Depolarizzazione della membrana tubulo T conseguente al potenziale d’azione sul sarcolemma; 2) modificazione conformazionale di una proteina sensibile al voltaggio sulla membrana del tubulo T ; 3) mediante accoppiamento meccanico diretto, apertura di grossi canali rilascianti Ca 2+ , situati nella membrana del RS da cui si estendono come pilastri sino alle proteine di membrana voltaggio dipendenti dei tubuli T; 4) fuoriuscita del Ca2+ nella fessura di giunzione tubulo T e RS provoca apertura di altri canali del Ca2+ ; 5)      flusso di Ca2+ nel citosol della fibra muscolare; 6)      contrazione contemporanea miofibrille (trasmissione segnale impiega pochi millisecondi) ricaptazione Ca2+ mediante ATPasi del Ca2+ ) 1)      depolarizzazione della membrana tubulo T conseguente al potenziale d’azione sul sarcolemma; 2)      modificazione conformazionale di una proteina sensibile al voltaggio sulla membrana del tubulo T ; 3)      mediante accoppiamento meccanico diretto, apertura di grossi canali rilascianti Ca2+, situati nella membrana del RS da cui si estendono come pilastri sino alle proteine di membrana voltaggio dipendenti dei tubuli T; 4)      fuoriuscita del Ca2+ nella fessura di giunzione tubulo T e RS provoca apertura di altri canali del Ca2+; 5)      flusso di Ca2+ nel citosol della fibra muscolare; 6)      contrazione contemporanea miofibrille (trasmissione segnale impiega pochi millisecondi) ricaptazione Ca2+ mediante ATPasi del Ca2+)

Inattivazione dei ponti trasversi e rilasciamento muscolare La rimozione di Ca 2+ dal sarcoplasma, operata dal reticolo sarcoplasmatico, mantiene [Ca2+] < 10 -7 M, 1) inattivazione ponti trasversi e rilasciamento muscolare; 2)  il rilasciamento non è prodotto dalla rimozione di ATP; il rilasciamento, come la contrazione si verifica solo se è presente Mg2+-ATP

Accoppiamento elettromeccanico Potenziale di membrana e contrazione Il potenziale d’azione della fibra nervosa motoria provoca: 1)     rilascio di acetilcolina; 2)     potenziale post-sinaptico; 3)     potenziale d’azione che dalla placca motrice si propaga nelle due direzioni eccitando tutta la membrana della fibra muscolare; 4)     periodo di latenza e contrazione muscolare del tipo tutto o nulla

1) diametro fibra muscolare elevato (50-100 m); Esponendo singole fibre muscolari di rana a varie [K+]est e registrando simultaneamente potenziale di membrana e tensione muscolare si osserva che aumentando depolarizzazione la tensione aumenta con andamento sigmoidale (Hogkin e Horowicz, 1960); -  ciò dimostra che il sistema contrattile è capace di una risposta graduata a gradi diversi di depolarizzazione; Nè tali variazioni di potenziale elettrico di membrana, né la possibile entrata di Ca2+ in cellula potevano attivare direttamente la > parte delle miofibrille perché: 1)     diametro fibra muscolare elevato (50-100 m); 2)     correnti di intensità fisiologica tra due elettrodi inseriti in una fibra muscolare non producevano alcuna contrazione; tasso di diffusione di uno ione, dalla membrana plasmatica al centro della fibra (25-50 m di raggio), troppo lento per spiegare la breve latenza (2 ms) tra potenziale d’azione e attivazione totale della fibra muscolare (Hill 1948). - quindi la scossa muscolare è di tipo tutto-o-nulla perché è di questo tipo il potenziale d’azione che, supera notevolmente il plateau al quale risulta saturata l’attivazione meccanica durante la depolarizzazione stazionaria. -  Esponendo singole fibre muscolari di rana a varie [K+]est e registrando simultaneamente potenziale di membrana e tensione muscolare si osserva che aumentando depolarizzazione la tensione aumenta con andamento sigmoidale (Hogkin e Horowicz, 1960); -  ciò dimostra che il sistema contrattile è capace di una risposta graduata a gradi diversi di depolarizzazione; Nè tali variazioni di potenziale elettrico di membrana, né la possibile entrata di Ca2+ in cellula potevano attivare direttamente la > parte delle miofibrille perché: 1)     diametro fibra muscolare elevato (50-100 m); 2)     correnti di intensità fisiologica tra due elettrodi inseriti in una fibra muscolare non producevano alcuna contrazione; tasso di diffusione di uno ione, dalla membrana plasmatica al centro della fibra (25-50 m di raggio), troppo lento per spiegare la breve latenza (2 ms) tra potenziale d’azione e attivazione totale della fibra muscolare (Hill 1948). -  quindi la scossa muscolare è di tipo tutto-o-nulla perché è di questo tipo il potenziale d’azione che, supera notevolmente il plateau al quale risulta saturata l’attivazione meccanica durante la depolarizzazione stazionaria.

Il reticolo sarcoplasmatico Il reticolo sarcoplasmatico (RS) che avvolge ogni miofibrilla da una linea Z all’altra, costituisce un compartimento delimitato da una membrana distinto dal sarcoplasma; le cisterne terminali dei reticoli sarcoplasmatici di due sarcomeri contigui entrano in intimo contatto con il tubulo T interposto tra essi. Quando vengono isolate, le membrane del reticolo sarcoplasmatico formano vescicole microscopiche (diametro 1 m) che possono captare Ca2+ dal mezzo circostante ed in presenza di ossalato si formano precipitati di ossalato di calcio; L’attività di sequestro di Ca 2+ operata dal reticolo sarcoplasmatico è abbastanza elevata da mantenere concentrazioni di Ca 2+ libero nel sarcoplasma del muscolo al di sotto di 10 -7M ; L’attività di sequestro del Ca 2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico è esercitata da una ATPasi – Ca 2+ presente sulla sua membrana, che corrisponde al 90% delle proteine di membrana dell’organello. E’ facilitata inoltre dalla calsequestrina, proteina legante Ca 2+ presente nell’interno del RS che riduce il gradiente di concentrazione di Ca 2+ contro cui deve lavorare la pompa

Regolazione del calcio da parte reticolo sarcoplasmatico. Stabilito che gli ioni Ca2+ sono accumulati dal reticolo sarcoplasmatico, appariva verosimile che la contrazione muscolare avvenisse in conseguenza del rilascio nel sarcoplasma del Ca2+ contenuto all’interno delle vescicole. La prova diretta che la concentrazione di Ca2+ aumenta in risposta alla stimolazione è stata ottenuta con metodo fotometrico che utilizza la proteina Ca2+ sensibile, equorina. Una molecola di equorina combinandosi con tre ioni Ca2+ emette un fotone di luce visibile; l’equorina è stata iniettata in fibre muscolari di crostacei che non hanno potenziali d’azione e la depolarizzazione della membrana può essere graduata; con un fotomoltiplicatore si registrano le variazioni di luce emessa quando il Ca2+ viene rilasciato dal RS; Una sufficiente depolarizzazione induce l’emissione di luce (> Ca2+) insieme ad una > tensione. La contrazione muscolare può essere indotta da caffeina o teofillina che stimolano rilascio di Ca2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico. La liberazione di Ca2+ da RS dipende dal livello del potenziale elettrico di membrana e si verifica a –50 mV ; la massima liberazione di Ca2+ si verifica a –20 mV.

Ruolo del Ca2+ nel muscolo cardiaco Studi con cuori isolati e perfusi con soluzioni saline isotoniche hanno dimostrato che rimozione di Ca 2+ extracellulare diminuisce forza contrattile, aumento di Ca 2+ incrementa forza contrattile. Meccanismo di accoppiamento eccitazione contrazione A) contrazione 1)      onda di eccitazione si propaga lungo il sarcolemma, trasferendosi di cellula in cellula mediante gap-junction; 2)      eccitazione si diffonde all’interno della cellula mediante tubuli T; 3)      stimolazione elettrica o applicazione di Ca 2+ ionizzato ad una stria z determina contrazione locale delle miofribrille vicine; 4)      durante plateau, Ca2+ entra tramite canali voltaggio dipendenti, attivati da fosforilazione mediata da protein-chinasi AMPc-dipendente; 5)      entrata di Ca 2+ innesca (Ca 2+ trigger) rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico; 6)      Ca 2+ aumenta nel citosol da 10 -7 a 10 -6-10 -5 M, legandosi alla troponina C; 7)      Complesso Ca2+-troponina interagisce con tropomiosina, sblocca i siti attivi fra filamenti di actina e miosina; Ruolo del Ca2+ nel muscolo cardiaco 8) interazione ponti trasversi che iniziano i loro cicli determinando contrazione miofibrille (sistole); A) decontrazione 1) Il reticolo sarcoplasmatico ricapta Ca 2+ mediante pompa del calcio stimolata dal fosfolambano dopo che questa sostanza è stata fosforilata da una protein-chinasi AMPc-dipendente; 2)      fosforilazione della troponina I inibisce fissazione Ca 2+ alla troponina C; 3)      inibizione della tropomiosina sui siti di interazione actina-miosina; 4)      rilasciamento muscolo cardiaco; 5)      il Ca 2+ entrato in cellula per iniziare la contrazione è rimosso durante la diastole dallo scambio elettrogenico di 3 Na+/ 1 Ca 2+ del sarcolemma (o ad opera di una ATPasi del Ca 2+ ) B) Regolazione 1)      catecolammine mediante AMPc accellerano sia la contrazione che la decontrazione del miocardio; 2)      glicosidi cardiaci, inibendo Na+/K+-ATPasi, diminuiscono gradiente elettrochimico del Na+ e quindi, indirettamente 3Na+/1Ca2+; Ca2+ intracellulare rimane elevata ed aumenta forza di contrazione

Ruolo del Ca2+ nel muscolo liscio -  E’ stato dimostrato che la miosina chinasi e la miosina fosfatasi fosforilano (a livello di un residuo di serina) e defosforilano rispettivamente uno specifico sito posto lungo le catene leggere regolatrici della miosina facenti parte del ponte trasverso; -  la fosforilazione è Ca2+-dipendente poiché forma attiva della miosina chinasi è un complesso con la calmodulina citoplasmatica legante 4 ioni Ca2+ (legame cooperativo) -  la fosforilazione è necessaria e sufficiente ad attivare l’idrolisi di ATP da parte di actina e miosina isolate da muscolo liscio; -  la rimozione del Ca2+ inattiva la miosin-chinasi con defosforilazione della miosina da parte della miosina-fosfatasi;

Fosforilazione ponti trasversali e contrazione - La fosforilazione è proporzionale alla concentrazione di Ca2+ nella contrazione fasica; - se i muscoli sono tonicamente stimolati, invece di incrementare ad un valore proporzionale alla stimolazione, la concentrazione di Ca2+ e la fosforilazione dei ponti trasversi, dopo un picco iniziale tendono a decadere a valori più bassi; - nonostante ciò la forza di contrazione aumenta e si mantiene elevata per tutto il periodo di stimolazione; - ciò conferisce al muscolo liscio un notevole vantaggio fisiologico; - ciò vuol dire anche che allo sviluppo della forza devono contribuire i ponti trasversali defosforilati - La fosforilazione è proporzionale alla concentrazione di Ca2+ nella contrazione fasica; - se i muscoli sono tonicamente stimolati, invece di incrementare ad un valore proporzionale alla stimolazione, la concentrazione di Ca2+ e la fosforilazione dei ponti trasversi, dopo un picco iniziale tendono a decadere a valori più bassi; - nonostante ciò la forza di contrazione aumenta e si mantiene elevata per tutto il periodo di stimolazione; - ciò conferisce al muscolo liscio un notevole vantaggio fisiologico; - ciò vuol dire anche che allo sviluppo della forza devono contribuire i ponti trasversali defosforilati

Regolazione covalente dei ponti trasversali   Secondo l’ipotesi correntemente accettata nei muscoli lisci contratti i ponti trasversali hanno 4 stati: liberi, attaccati, fosforilati e defosforilati; -  La miosin-chinasi e la miosina fosfatasi possono agire sui ponti trasversali sia liberi che attaccati; -  I ponti trasversali fosforilati hanno un ciclo relativamente veloce (più lento rispetto al muscolo striato); -      Un ciclo lento (fosforilazione, attacco, defosforilazione, distacco) che utilizza 2 molecole di ATP; -      Se la Ca2+ è si innalza, l’attività della miosin-chinasi sarà elevata e gran parte dei ponti trasversi saranno fosforilati, producendo un rapido aumento della forza di contrazione; -      Quando Ca2+ scende a livelli moderati, la fosforilazione si riduce, ma la forza viene mantenuta dalla persistenza dei ponti trasversali allo stato 4, poiché la loro velocità di distacco è bassa; Queste caratteristiche consentono al muscolo liscio di eseguire contrazioni fasiche veloci e sostenere carichi imposti durante contrazioni toniche prolungate

Regolazione della concentrazione mioplasmatica del calcio Il sarcolemma regola gli scambi di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - le membrane del reticolo sarcoplasmatico regolano invece il movimento di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - il fatto che esistano numerosi meccanismi per regolare il Ca2+ mioplasmatico è fisiologicamente importante poiché: 1)      i muscoli lisci devono produrre vari tipi di attività meccanica; 2) l’attività delle diverse cellule deve essere coordinata tra loro;   Ruolo del reticolo sarcoplasmatico L’attivazione di RS, non dipendente da variazioni di potenziale di membrana, ma dal legame di IP3 con i suoi recettori, apre i canali del Ca2+ determinando il rapido incremento della sua concentrazione plasmatica (risposta fasica); - Il sarcolemma regola gli scambi di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - le membrane del reticolo sarcoplasmatico regolano invece il movimento di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - il fatto che esistano numerosi meccanismi per regolare il Ca2+ mioplasmatico è fisiologicamente importante poiché: 1)      i muscoli lisci devono produrre vari tipi di attività meccanica; 2) l’attività delle diverse cellule deve essere coordinata tra loro;   Ruolo del reticolo sarcoplasmatico L’attivazione di RS, non dipendente da variazioni di potenziale di membrana, ma dal legame di IP3 con i suoi recettori, apre i canali del Ca2+ determinando il rapido incremento della sua concentrazione plasmatica (risposta fasica); Ruolo del sarcolemma Riduzione concentrazione mioplasmatica di Ca2+ avviene mediante lo scambio 3 Na+/ 1 Ca2+ e l’ATPasi del Ca2+; la contrazione tonica dipende dall’entrata del Ca2+ dal pool extracellulare, attraverso il sarcolemma, mediante due tipi di canali: 1)          attivati da recettori per neurotrasmettitori o ormoni inibitori cui sono collegati mediante proteine G (accoppiamento farmaco-meccanico); 2)          voltaggio-dipendenti la cui conduttanza aumenta con la depolarizzazione; pertanto potenziali d’azione, depolarizzazioni graduate (< attività della Na+/K+-ATPasi; depolarizzazioni trasmesse da altre cellule mediante gap-junction. Ruolo del sarcolemma Riduzione concentrazione mioplasmatica di Ca2+ avviene mediante lo scambio 3 Na+/ 1 Ca2+ e l’ATPasi del Ca2+; la contrazione tonica dipende dall’entrata del Ca2+ dal pool extracellulare, attraverso il sarcolemma, mediante due tipi di canali: 1) attivati da recettori per neurotrasmettitori o ormoni inibitori cui sono collegati mediante proteine G (accoppiamento farmaco-meccanico); 2) voltaggio-dipendenti la cui conduttanza aumenta con la depolarizzazione; pertanto potenziali d’azione, depolarizzazioni graduate (< attività della Na+/K+-ATPasi; depolarizzazioni trasmesse da altre cellule mediante gap-junction.