ANALISI DI BIOMOLECOLE

PROTEINE E AMINOACIDI proteina Amino acidi Determinazione della struttura primaria HCl 6N proteina Amino acidi 110°C 24-72 ore In queste condizioni drastiche alcuni amino acidi, come cisteina, triptofano Asparagina, glutamina vengono distrutti Accorgimenti specifici

Separazione e quantificazione degli amino acidi nell’idrolizzato derivatizzazione 1-Dopo 2-Prima separazione

1-Derivatizzazione dopo separazione: -separazione su colonna a scambio ionico -reazione con ninidrina

Gli amino acidi vengono fatti ragire a 100°C con la ninidrina Si formano derivati colorati che vengono letti a 570 nm

2-Derivatizzazione prima della seprazione -Reazione con dansil cloruro fenilisotiocianato o-ftaldeide -Separazione su HPLC

Separazione su HPLC

Rottura dei ponti disolfuro

Determinazione della struttura primaria Metodo chimico Degradazione di Edman Metodo basato sul DNA ricombinante

Tappe sequenziali Analisi sequenziale della porzione N-terminale della proteina 2) Scissione della proteina in peptidi, mediante proteolisi chimiche o enzimatiche metodi enzimatici: tripsina chimotripsina proteasi A proteasi V8 metodi chimici: BrCN 3) Separazione dei peptidi ottenuti 4) Analisi degli amminoacidi di ciascun peptide 5) Analisi sequenziale di ciascun peptide (Edman) 6) Allineamento dei peptidi

Polypeptide Fragmentation Cleavage by Endopeptidases NH CH C O Rn-1 Rn Trypsin Rn-1 = Arg or Lys (positively charged side chains) Rn ≠ Pro (highly specific enzyme; most useful) Chymotrypsin Rn-1 = Phe or Trp or Tyr scissile peptide bond Enzyme: Specificity:

N C trypsin chymotrypsin CNBr

Informazioni sulla proteina ottenuta Confronto con le altre proteine conosciute Confronto con la stessa proteina in specie diverse Sequenze per la localizzazione cellulare Ipotesi sulla struttura secondaria Sito attivo e mutazioni Sintesi sonde oligonucletidiche

Struttura secondaria e terziaria Molto difficoltosa Molto importante il contributo della tecnologia del DNA ricombinante Metodi spettrofluorimetria Dicroismo circolare NMR Cristallografia ai raggi X

5) Spettrofluorimetria La fluorescenza è un fenomeno di emissione. La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è accompagnata da una emissione di radiazione piuttosto che assorbimento. Affinchè ciò avvenga deve prima avvenire un evento di eccitazione, ad es. causato da assorbimento di radiazione elettromagnetica. La l della radiazione di assorbimento deve essere più bassa (energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza di queste due l è nota come “shift di stokes”. E’ possibile per un composto assorbire (o essere eccitato) nel UV ed emettere (o fluorescere) nel visibile. Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadi- mento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata. L’emissione della luce avviene a l maggiori della fluorescenza.

Il meccanismo di diseccitazione con emissione di un fotone è quello che accade in fluorescenza. Le proteine sono macromolecole facilmente studiabili con la tecnica della spettrofluorimetria in cui la lunghezza d'onda dell'energia emessa è maggiore della lunghezza d'onda dell'energia assorbita. L’aumento di lunghezza d'onda è chiamato spostamento o shift di Stokes. Poiché un quanto è pari all'energia necessaria per permettere il salto di un elettrone, l'efficienza quantica Q è il rapporto tra i quanti emessi per fluorescenza e i quanti assorbiti ed è indipendente dalla lunghezza d'onda della luce di eccitamento. A basse concentrazioni, vale la relazione seguente tra l'intensità di fluorescenza If e la radiazione incidente Io: If  = Io 2,3 e l c d Q dove c=concentrazione molare del composto fluorescente;         d=cammino ottico, in cm, della soluzione fluorescente;         e= coefficiente di estinzione molare del composto che assorbe alla lunghezza d'onda l

La tecnica della spettrofluorimetria è accurata a basse concentrazioni dove la spettrofotometria non lo è. 100 pg catecolamine spettrofluorimetria 100 mg catecolamine spettroscopia Selettività spettrale Strumentazione: due monocromatori controllo T E’ influenzata dal pH, temperatura, polarità del solvente ma soprattutto dal “quenching” -----> la luce emessa viene persa per collisione con altre molecole ====> bassa concentrazione

Applicazioni Molte anche se pochi composti manifestano questo fenomeno. Il rilevamento di un composto non fluorescente può essere ottenuto legandolo ad un probe fluorescente (fluorescenza estrinseca). Se invece il composto nativo ha fluorescenza (fluorescenza intrinseca). aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds. L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti in scarsa quantità: vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi, carcinogeni,…..

Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded che unfolded Spettrofluorimetria e studio del folding di una proteina La fluorescenza è diversa a seconda dell’ambiente più o meno polare dell’ambiente proteico in cui si trovano e risente dell’effetto quenching creato dall’interazione con altre molecole o altre struttura chimiche delle proteine (ponti disolfuro) Le fluorescenze sono diverse a seconda che conservino la struttura terziaria o no La denaturazione comporta un allungamento dello shift di Stokes e del cambiamento di intensità dello spettro di emissione Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded che unfolded E’ possibile calcolare la % di proteina nei due stati

fu = (yf - y) / (yf - yu) fu: frazione unfolded; yf : fluorescenza della proteina folded; yu: fluorescenza della proteina unfolded Y: fluorescenza del campione ad una particolare concentrazione di denaturante

Spettroscopia in dicroismo circolare (CD) Questo tipo di spettroscopia sfrutta la capacità degli isomeri ottici di ruotare il piano della luce polarizzata. La luce può essere polarizzata in modo da selezionare le onde elettromagnetiche che oscillano su uno stesso piano mediante il passaggio della luce attraverso uno schermo polarizzante o un prisma di Nicol. La radiazione polarizzata in un piano corrisponde alla sovrapposizione di onde polarizzate circolarmente a destra e a sinistra della stessa intensità.

Se le due onde polarizzate circolarmente a destra e a sinistra hanno intensità diversa, la radiazione derivante dalla loro somma è polarizzata ellitticamente. Questa tecnica permette di misurare la variazione dell'angolo di polarizzazione dopo che la luce ha attraversato una sostanza chirale (otticamente attiva). Entrando in un materiale che assorbe differentemente la radiazione circolarmente polarizzata a destra e quella circolarmente polarizzata a sinistra, la luce incidente, polarizzata nel piano, esce polarizzata ellitticamente. L'ellitticità q è il parametro che viene misurato nella spettroscopia CD ed è dato da: q = 2.303 DE (180/4 p) = 33 DE gradi     DE è dato dalla differenza tra le componenti R ed L.

APPLICAZIONI La principale è lo studio della conformazione delle macromolecole biologiche che si integra con dati di NMR. PROTEINE Si possono avere informazioni sulla proporzione relativa delle strutture secondarie (a eliche, foglietti b) presenti in una proteina in soluzione. Nelle regioni del cosiddetto near UV si possono identificare picchi che derivano dal contributo alla rotazione della luce polarizzata fornito da residui di triptofano (intorno a 290 nm) di Phe e Tyr intorno a 280 nm e del disolfuro intorno a 270 nm. - Determinazione della struttura secondaria di una proteina Studio dell’effetto del legame di farmaci sulle proteine Folding /denaturazione delle proteine Studio di interazione proteina-proteina e proteina-DNA

Il segnale CD di una proteina dipende dalla sua struttura secondaria

Gli spettri CD possono essere interessanti per: - distinguere B, A e Z DNA; - studiare variazioni della struttura causate da modificazione del pH, della forza ionica o anche dall'interazione con DNA binding proteins. Circular dichroism spectroscopy of HMGI-C binding to DNA. Near-UV CD spectrum of 2 mM double-stranded CAnt1 oligonucleotide +/- 2 mM HMGI-C (1:1 molar ratio). The ellipticity values are given in terms of the molar concentration of oligonucleotides. The solid line represents the oligonucleotide alone, while the dashed line represents the oligonucleotide plus protein.

7. Turbidometria e nefelometria Utilizzate per determinare la concentrazione di sospensioni diluite. Nella turbidometria viene misurato l’assorbimento apparente della radiazione quando attraversa la sospensione. La legge di Lambert e Beer non è applicabile . Non avviene assorbimento ma fenomeni di dispersione in cui la luce è diffratta dalle particelle sospese. Si usa sempre lo spettrofotometro. APPLICAZIONI Misura di sospensioni di microrganismi (batteri, lievito) lettura a 600 nm.

Cristallografia ai raggi X Sono necessari cristalli di proteina Componenti di una determinazione cristallografica

-La deviazione è proporzionale al numero di elettroni -Le onde diffratte si rinforzano l’un l’altra se sono in fase o si si cancellano se sono fuori fase -La ricombinazione delle onde diffratte dipende dalla disposizione degli atomi

Lipidi relativa insolubilità in acqua estrazione con solventi organici: acetone, etere, cloroformio in diversi rapporti tra loro. E’ possibile estrarre selettivamente alcune classi di lipidi. Solventi non polari, come esano, etere, cloroformio permettono l’estrazione di lipidi neutri da tessuti adiposi. I lipidi di membrana richiedo solventi più polari metanolo ed etanolo. Utilizzati sono anche i metodi cromatografici: cromatografia di adsorbimento e cromatografia su strato sottile.

Misurazione del glicerolo I trigliceridi possono essere determinati misurando il glicerolo rilasciato dopo idrolisi seguita da una reazione enzimatica accoppiata (test ottico accoppiato): triacilglicerolo glicerolo + acidi grassi

Misurazione del colesterolo Il colesterolo viene determinato per reazione enzimatica con colesterolo ossidasi. L’acqua ossigenata liberata può essere determinata colorimetricamente:

Estrazione DNA ed RNA Lisi cellulare Rimozione delle proteine (estrazione organica fenolo/cloroformio equilibrata a pH acido o neutro) Precipitazione acidi nucleici con etanolo Separazione DNA/RNA (centrifugazione)

Importanza del pH della saturazione del fenolo . pH neutro o alcalino Fase acquosa (DNA e RNA) Interfaccia (proteine denaturate) Fase fenolica (proteine solubili) pH acido Fase acquosa ( RNA) Fase fenolica (proteine solubili e DNA) Importanza del pH della saturazione del fenolo