PROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck: E = h  n Campo magnetico Campo elettrico Direzione di propagazione l l : lunghezza d’onda a a : ampiezza d’onda PROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE n : frequenza d’onda

tempo ampiezza spazio l n = 2 Hz 1 s tempo ampiezza spazio l n = 4 Hz 1 s E’ importante ricordare che frequenza e lunghezza d’onda non si possono confrontare sullo stesso grafico Lunghezza d’onda, frequenza e velocità di una qualsiasi onda elettromagnetica sono correlate dalla relazione c = l  n

luminosa), diminuisce anche la lunghezza d’onda. Passando dall’aria al vetro, la velocità di propagazione diminuisce a causa dell’indice di rifrazione; pertanto, rimanendo costante la frequenza (dipendente solo dalla sorgente luminosa), diminuisce anche la lunghezza d’onda. Variazione di l con l’indice di rifrazione del mezzo ampiezza distanza aria vetro n = 6,0 x 1014 Hz l = 500 nm l = 350 nm

REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO Frequenza, Energia Onde radio Microonde IR lontano IR medio IR vicino Visibile UV vicino UV lontano Raggi X 1-1000 m 0,1-100 cm 50-1000 mm 2,5-50 mm 0,75-2,5 mm 400-750 nm 200-400 nm 10-200 nm 10-2- 100 Å l 1 Å = 10 -10 m 1 nm = 10 -9 m 1 mm = 10 -6 m

REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO Principali applicazioni delle diverse onde

INTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTE E0 , E1 , E2 : livelli elettronici v0 , v1 , v2 : livelli vibrazionali r0 , r1 , r2 : livelli rotazionali L’energia assorbita viene ceduta per diseccitazione termica o, più raramente, radiativa (fluorescenza o fosforescenza)

energia che attraversa un’area unitaria in un secondo (J/sec) SPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILE Soluzione campione I0 (P0) I (P) Potere radiante (P): energia che attraversa un’area unitaria in un secondo (J/sec) Intensità (I): potere radiante per unità di angolo solido (steradiante) della sorgente TRASMITTANZA I I0 T = 0 ≤ T ≤ 1 0% ≤ T ≤ 100% ASSORBANZA T 1 A = - log T = log = log I I0 0 ≤ A ≤ ∞ numeri adimensionali

radiante r steradiante

corrisponde un massimo Spettro di assorbimento: diagramma ottenuto misurando l’assorbanza in funzione di l Spettro di assorbimento della clorofilla lmax lmax : lunghezza d’onda a cui corrisponde un massimo di assorbimento

Valida per radiazioni monocromatiche cammino ottico b LEGGE DI LAMBERT-BEER I0 I I0 I I’ Valida per radiazioni monocromatiche dn - dI’ = KI’ dn dI’ = - Kdn I’ I = e-a’bc I0 T = e-a’bc N° totale molecole passando ai log e ponendo a = a’log e dI’ I’ = - K dn ∫ N I0 I ln I = - KN I0 log T = -abc T = 10-abc Poiché A = - log T ponendo N = K’bc (c: conc. soluzione) A = - log 10-abc = abc ln I = - (K · K’)bc = - a’bc I0 A = abc

A A = abc A = a b c a = e Per b = c = 1 A = a (assorbività, costante per l costante) coefficiente di estinzione (o assorbanza specifica) se b espresso in cm e c in g/L A = a b c coefficiente di estinzione molare (o assorbanza specifica molare) se b espresso in cm e c in mol/L a = e A 1% 1 cm : in F. U. estinzione specifica di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm concentrazione A

Deviazioni dalla legge di Lambert-Beer a) deviazioni fisiche - a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente generando deviazioni positive o negative concentrazione A - a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la l della radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione viene misurata, di fatto, a l diverse con scostamento dalla linearità

b) deviazioni strumentali Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la banda passante Skoog, West, Holler, Crouch Banda passante: intervallo di radiazioni isolate dallo strumento e convogliate sulla soluzione in esame

c) deviazioni chimiche Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico tra due specie Cr2O7 2- + H2O CrO4 2- + 2H+ Esempio: lmax: 372 nm lmax: 450 nm Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10: Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10: Se a 372 nm e pH = 1, Assorbanza (CrO4 2-) = x Se a 450 nm e pH = 1, Assorbanza (Cr2O7 2-) = y Assorbanza (Cr2O7 2-) < 1 y 10 Assorbanza (CrO4 2-) > 1 x 10

- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti ANALISI QUANTITATIVA Viene effettuata quasi sempre in corrispondenza della lmax in modo che: - aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (vedi prima) - aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti A = abc Sensibilità = dA = ab dC La sensibilità è cioè  al cammino ottico b e al coefficiente di estinzione a

ANALISI IN ASSORBIMENTO a) Metodo di confronto Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo e limitato alle soluzioni colorate Ax A1 A2 A3 A4 Ax = A1 Mantenendo il cammino ottico costante, se Ax = A1 cx = c1 E’ possibile anche usare una sola soluzione standard e variare i cammini ottici fino a quando: Ax = A1 a bx cx = a b1 c1 cx = b1 c1 bx

Ax = a b cx b) Metodo diretto c) Metodo retta di taratura A Conoscendo il coefficiente di estinzione a (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico b, è possibile risalire alla concentrazione cx Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione che andrebbe preliminarmente verificata Conc. A c) Metodo retta di taratura A1 c1 A2 c2 A3 c3 Ax cx

d) Metodo delle aggiunte (per matrici complesse) mg x x + a a A1 Ax - aggiunta singola (di analita puro) x x + a - aggiunte multiple x x + a x + 2a x + 3a A mg a A1 2a A2 3a A3 x Ax

Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / l Spettri in derivata: Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / l l A Spettro UV-Vis Derivata 1a Derivata 2a Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il rumore di fondo

Analita 2 Analita 1 A Spettro UV-Vis l Derivata 2a Analita 1 Analita 2 Gli spettri in derivata consentono una migliore risoluzione di bande sovrapposte negli spettri normali A l Spettro UV-Vis Analita 1 Analita 2 Derivata 2a Analita 2 Analita 1

ADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZE Nel caso di due sostanze: x + y l1 l2 x Atot = S Ai = S ai b ci y l1 A1 = A1x + A1 y = a1x b cx + a1y b cy Nel caso di due sostanze: l2 A2 = A2x + A2 y = a2x b cx + a2y b cy

Ais = ais b [HA] + ais b [A- ] Punto isosbestico: punto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibrio A l pH: 7.0 Es.: HA H+ + A- pH: 6.0 pH: 5.0 pH: 3.0 pH: 4.0 Ais = ais b [HA] + ais b [A- ] = ais b ( [HA] + [A- ]) = ais b ctot

Operazioni di taratura 0% corpo opaco campione analitico TRASMITTANZA 100% bianco soluzione identica al campione analitico, ma priva dell’analita azzeramento operazione di bianco ASSORBANZA Limiti di trasparenza (cut off) di alcuni solventi: Acqua 180 -195 nm Metanolo 200 -210 nm Cloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nm

Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60% Errore fotometrico 20 40 60 80 100 ± 1.0 ± 2.0 ± 3.0 ± 5.0 ± 4.0 Trasmittanza % Errore % relativo Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60% Assorbanza: 0.2 - 0.7

Assorbimento molecolare di una radiazione Per una molecola: Etot = E nucleare + E elettronica + E vibrazionale + E rotazionale + E traslazionale Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile transizioni elettroniche Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO) E N R G I A Orbitale molecolare antilegante Orbitale atomico Orbitale molecolare legante

Diagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolari R G I A s* p* antileganti } Scarso interesse analitico: assorbimenti nell’UV lontano n non legante p s leganti } Es. di lmax per s s* CH4: 125 nm ; C2H5: 135 nm Es. di lmax per n s* H2O: 167 nm ; CH3OH: 185 nm

Transizioni elettroniche n p* (R o radicaliche come quelle n s*) Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di assorbività (e ≤ 102, transizioni proibite dalle cosiddette regole di selezione quanto- meccaniche) Esempio: acetone, lmax (esano) 279 nm, e ~ 20 Transizioni elettroniche p p* Collocazione variabile: ~ 160-230 nm (sistemi p isolati, transizioni E o etileniche) ~ 250-280 nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoidi) ~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazione) lmax (cloroformio): 466, 497 nm b-carotene

Spettro di assorbimento della 1,2,4,5-tetrazina in tre diverse condizioni Vapore Soluzione di esano acquosa Lunghezza d’onda, nm Assorbanza [Skoog-West-Holler] { E0 E1 Possibili transizioni tra due livelli elettronici con sottolivelli vibrazionali e rotazionali

Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitabili CROMOFORI Gruppi funzionali insaturi le cui transizioni elettroniche danno luogo ad assorbimento nel visibile e nel vicino UV Cromofori più comuni: C N O S Sistemi aromatici in genere Ogni cromoforo ha  di massimo assorbimento (max) e coefficienti di estinzione  caratteristici che variano però in funzione del solvente e della struttura molecolare complessiva Cromoforo Transizione lmax e C = O p p* 180 9000 n s* 200 -- n p* 280 20 Possibili transizioni per un carbonile

Fattori che influenzano il valore di  - Probabilità della transizione elettronica  > 104 probabilità elevata  < 103 probabilità bassa - Variazione del momento dipolare legato alla transizione L’assorbimento è tanto più intenso quanto maggiore la separazione di carica nello stato eccitato - Natura del solvente - Tipo di sostituenti Influenzano sia la probabilità di transizione che la variazione del momento dipolare Effetto ipercromico: aumento del valore di  Effetto ipocromico: diminuzione del valore di 

Fattori che influenzano il valore di max Effetto batocromico (red shift): spostamento della lmax verso valori più alti (frequenza ed energia più basse) Possibili cause solvente: importante la polarità coniugazione con altri cromofori sostituenti iperconiugazione coniugazione con auxocromi Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame; la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia di lmax che di e Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solvente o da interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico

Effetti sulla transizione p p Effetti sulla transizione p p* dell’iperconiugazione e della coniugazione con auxocromi cromoforo lmax e CH2 = CH2 162 10.000 CH2 = CH – CH3 168 CH3 – CH = CH – CH3 177 11.000 CH3 – CH = C – (CH3)2 187 12.000 (CH3)2 – C = C – (CH3)2 196 12.400 Cl – CH = CH – Cl 193

Cromofori multipli Se non coniugati: e sono additivi - lmax costante CH3CH2CH2CH=CH2 lmax= 184 emax = ~10,000 CH2=CHCH2CH2CH=CH2 lmax=185 emax = ~20,000 Se coniugati: - effetto batocromico - effetto ipercromico H2C=CH-CH=CH2 lmax=217 emax = ~21,000

Distribuzione degli orbitali in dieni coniugati energia N° doppi legami Esatriene (e: 25.000) 258 nm p4* p5* p6* p3 p2 p1 Butadiene (e: 21.000) 217 nm p1 p2 p3* p4* Etilene (e: 10.000) 162 nm p p* b-carotene (e: 100.000) 450 nm

Sistemi aromatici Si possono considerare sistemi polienici coniugati; sono caratteristici sia il comportamento chimico che spettroscopico lmax: 184 nm (e = 60.000) e 204 nm (e = 7.900) (bande etileniche E1 e E2) lmax: 256 nm (e = 200) (banda benzenoide B a struttura fine) Solo la prima (E1) non è “proibita” ed è infatti la più intensa benzene

Effetto del pH sull’assorbimento È legato alla presenza di gruppi funzionali ionizzabili Esempi:

Assorbimento nei composti inorganici Transizioni elettroniche nei metalli di transizione (orbitali d) Caso classico: ioni complessi a struttura ottaedrica Co(NH3)62+ Co(H2O)62+

Teoria del campo cristallino Energia (complesso ottaedrico) Orbitali d D0 Orbitali d Di solito D0 è piccolo per cui la transizione avviene per assorbimento nella regione del visibile (soluzioni colorate) (nessun legante)

Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante Transizioni per trasferimento di carica Transizione intramolecolare: tipica dei composti di coordinazione, ma anche di ioni quali MnO4-, CrO42-….; di solito consiste nel trasferimento di un elettrone dal legante al metallo Esempio 1: FeSCN2+ Fe3+ -------- -SCN Fe2+ -------- SCN . hn Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante Esempio 2: ferroina: hn

tra la la molecola di I2e quella di amido che l’avvolge a spirale Transizione intermolecolare: tipico esempio è quello del complesso I2-benzene in cui un elettrone oscilla tra la nuvola p del benzene ed un orbitale vuoto di I2 + I2 Soluzione Marrone scuro hn Un altro esempio classico è quello del complesso I2-amido in cui un elettrone oscilla tra la la molecola di I2e quella di amido che l’avvolge a spirale Amido + I2 Soluzione blu hn

COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA UV La colorimetria è limitata alla regione del visibile ed utilizza colorimetri fotoelettrici La spettrofotometria UV è più affidabile, più versatile ed utilizza spettrofotometri Caratteristiche principali: campo di indagine esteso dal vicino UV (~ 200 nm) al vicino IR (~ 1000 nm) condizioni di quasi monocromaticità delle radiazioni utilizzate continuità con cui può essere variata la lunghezza d’onda della radiazione

Componenti di colorimetri fotoelettrici e spettrofotometri Selezionatore di lunghezza d’onda Sorgente radiante Cella Rivelatore

Sorgenti radianti Emettono radiazioni policromatiche contenenti cioè le lunghezze d’onda della regione richiesta Le sorgenti possono essere continue (a) o a righe (b) Skoog, West, Holler, Crouch

Wsublimato + I2 WI2 (gas) W + I2 Regione del visibile lampade a filamento di tungsteno (bulbo in vetro) temperatura di esercizio ~ 3000 K intervallo utile di l ~ 2200 ÷ ~ 350 nm l (nm) 3400 K 2200 K 2600 K 3000 K Intensità relativa Emissione luminosa di un corpo incandescente lampade a tungsteno/alogeno (bulbo in quarzo) temperatura di esercizio ~ 3500 K intervallo utile di l ~ 2500 ÷ ~ 240 nm vita media doppia rispetto alla precedente Wsublimato + I2 WI2 (gas) W + I2 filamento caldo si rideposita sul filamento

ED’ e ED’’ : energie cinetiche dei due atomi di deuterio Regione dell’UV lampade a scarica elettrica in vapori di deuterio (bulbo in quarzo) intervallo utile di l ~ 380 ÷ ~ 160 nm meccanismo di emissione legato all’eccitazione di D2: D2 D2* D’ + D” + hn Scarica elettrica Fotone di luce ED2* = ED’ + ED’’ + hn ED’ e ED’’ : energie cinetiche dei due atomi di deuterio ED’ + ED’’ può variare in modo continuo tra 0 e ED2*, quindi anche hn può farlo: il risultato è uno spettro di emissione continuo lampade a scarica elettrica in vapori di mercurio (bulbo in quarzo) spettro di emissione a righe (UV e visibile) usi analitici particolari soprattutto nella regione dell’UV Gli spettrofotometri hanno quindi al loro interno due diverse lampade, una per il visibile e l’altra per l’UV opportunamente intercambiate. Nei modelli più recenti un’unica lampada allo xenon copre tutto lo spettro (~ 200 ÷ ~ 1100 nm)

lunghezza d’onda nominale Selezionatori di lunghezze d’onda Hanno la funzione di scomporre la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. Sono di due tipi: filtri e monocromatori. La caratteristica principale, in entrambi i casi, è l’ampiezza della banda passante: intervallo di radiazioni che emerge dal selezionatore con un’energia almeno pari al 50% di quella della radiazione nominale Lunghezza d’onda lunghezza d’onda nominale

Skoog, West, Holler, Crouch Filtri Usati nei colorimetri fotoelettrici Filtri di assorbimento: ampiezza di banda 30 ÷ 250 nm trasmittanza 5 ÷ 30% uso nel visibile (vetro) Filtri a interferenza: ampiezza di banda 5 ÷ 20 nm trasmittanza 50 ÷ 60% uso nel visibile e UV costo più elevato

Monocromatore a prisma Monocromatori Consentono di selezionare con continuità le radiazioni di qualsiasi lunghezza d’onda Monocromatore a prisma n1 : indice di rifrazione dell’aria n2 : indice di rifrazione del prisma i : angolo di incidenza r : angolo di rifrazione Quando una radiazione luminosa attraversa la superficie di separazione di due mezzi trasparenti, il raggio rifratto si piega verso la normale alla superficie se il secondo mezzo è più denso del primo. L’angolo di rifrazione r è funzione della l della radiazione.

Schema ottico di un monocromatore a prisma fenditura di ingresso lente collimatrice prisma focalizzatrice uscita l1 l2 S sorgente

Scomposizione spettrale operata da tre diversi tipi di monocromatori assorbimento 400 500 600 700 200 nm prisma di vetro 200 nm 300 350 400 500 700 prisma di quarzo 400 200 nm 300 500 600 700 monocromatore a reticolo N.B. : nel visibile, il prisma di vetro è preferibile a quello di quarzo (maggiore dispersione)!

Fenomeno della diffrazione Sorgente radiante Immagine di una fenditura di larghezza variabile su uno schermo illuminato con luce monocromatica Fenomeno della diffrazione frange di diffrazione ordine zero Sorgente radiante Sorgente radiante

Interferenza costruttiva e distruttiva di una radiazione monocromatica intensità tempo Onde in concordanza di fase Onde in opposizione di fase l A 2A

Monocromatori a reticolo di diffrazione http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&feature=related Monocromatori a reticolo di diffrazione Sono di due tipi: reticoli di trasmissione e reticoli di riflessione Reticoli di trasmissione Costituiti da sottilissime fenditure (600 ÷ 2000/mm) incise su una superficie rivestita di alluminio. Ampiezza delle fenditure e distanza sono dello stesso ordine di grandezza delle radiazioni incidenti. Comportamento delle radiazioni in un reticolo di trasmissione m m = passo del reticolo a = m senb  b a Collegarsi al sito web “linkato” sulla diapositiva! Il sito a cui collegarsi è: http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&feature=related Le radiazioni si sommano solo se: m senb = K l (K = 0, 1, 2, 3…..) 

frangia di ordine zero: Diffrazione di luce policromatica Sorgente radiante frangia di ordine zero: luce bianca Spettro del 1° ordine Ovviamente nello spettro del 1° ordine, come di quelli successivi, sono da includere anche le radiazioni appartenenti a regioni diverse dal visibile!

cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro! Dispersione di luce bianca attraverso un reticolo di trasmissione Cozzi, Protti, Ruaro Gli spettri dei vari ordini sono tutti lineari in funzione della lunghezza d’onda, cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro!

ottenuti con i reticoli di trasmissione Reticoli di riflessione Costituiti da una serie di solchi (100 ÷ 2000/mm) tracciati sopra una superficie riflettente, piana o concava. I reticoli più comuni sono quelli a gradini: In questo caso, sono i raggi riflessi a dar luogo ai fenomeni di interferenza costruttiva o distruttiva del tutto simili a quelli ottenuti con i reticoli di trasmissione Esempio di diffrazione osservabile guardando con luce radente un comune compact disc!

Cellette di assorbimento (cuvette) Hanno la funzione di contenere la soluzione in esame e quella del riferimento Cuvette in vetro o materiale plastico (polistirene, metacrilato) visibile Cuvette in quarzo UV, visibile Hanno volume variabile e spessore (cammino ottico) che può variare da pochi mm ad alcuni cm (di solito 1 cm)

Rivelatori hn = E0 + ½ mv2 Fototubi e fotomoltiplicatori Sono trasduttori che convertono l’energia radiante in corrente elettrica misurabile con un galvanometro. La corrente elettrica che si genera è direttamente proporzionale all’intensità della radiazione luminosa. Fototubi e fotomoltiplicatori Il loro funzionamento si basa sull’effetto fotoelettrico Relazione di Einstein per l’effetto fotoelettrico: hn = E0 + ½ mv2 energia fotone potenziale ionizzazione del metallo Energia cinetica dell’elettrone

Skoog, West, Holler, Crouch Fototubi Skoog, West, Holler, Crouch Involucro di vetro o quarzo sotto vuoto Catodo Anodo a filamento Fascio di fotoni elettroni 90 V Amplificatore e misuratore Il catodo è ricoperto da uno strato di materiale fotoemissivo (generalmente cesio)

Fotomoltiplicatori Simili ai fototubi ma molto più sensibili. Si basano sul fenomeno dell’emissione secondaria. Skoog, West, Holler, Crouch Griglia Radiazione Catodo fotoemissivo Dinodi D1-D9 Numerosi elettroni per ogni fotone per ogni elettrone Involucro di quarzo Anodo Sezione trasversale Dinodi Catodo Anodo 90 V 900 V Involucro di quarzo Amplificatore Lettura Producono correnti 105 ÷ 107 volte più intense di quelle di un fototubo per cui possono essere usati solo per misure di bassi valori di intensità luminosa!

che lascia una lacuna positiva anch’essa mobile come l’elettrone Rivelatori a serie di fotodiodi (DAD) Fotodiodo: dispositivo costituito da una giunzione tra un semiconduttore di tipo p ed uno di tipo n Semiconduttore: materiale la cui conducibilità elettrica è intermedia tra quella di un conduttore (metallo) e quella di un isolante Esempio: silicio cristallino Si La conducibilità elettrica è legata all’eccitazione termica di un elettrone (di conduzione) che lascia una lacuna positiva anch’essa mobile come l’elettrone

Semiconduttore di tipo n: semiconduttore drogato con eccesso di elettroni di conduzione Skoog, West, Holler, Crouch Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del V gruppo (As) Semiconduttore di tipo p: semiconduttore drogato con eccesso di lacune elettroniche Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del III gruppo (Ga)

Polarizzazione diretta Polarizzazione inversa Skoog, West, Holler, Crouch Schema di un fotodiodo al silicio Giunzione pn Contatto metallico Buca Elettrone Conduttore Regione p Regione n Regione p Regione n Polarizzazione diretta Polarizzazione inversa Regione p Regione n Strato di deplezione Le condizioni di polarizzazione inversa sono quelle utilizzate nei rivelatori DAD

Schema ottico di uno spettrofotometro con rivelatore DAD Skoog, West, Holler, Crouch Sorgente Otturatore Specchio Cella Reticolo di diffrazione Fenditura Serie di fotodiodi Acquisizione dello spettro in tempo reale! La sensibilità del DAD è intermedia tra quella di un fototubo e quella di un fotomoltiplicatore.

Skoog, West, Holler, Crouch Schema ottico di spettrofotometro a raggio singolo Sorgente hn Monocromatore Schermo Cuvetta di riferimento Cuvetta del campione Rivelatore Amplificatore Lettore I0 Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nello spazio Skoog, West, Holler, Crouch Sorgente Monocromatore Schermo Cuvetta di riferimento I I0 Cuvetta del campione Rivelatore 1 Rivelatore 2 Amplificatore differenziale Lettore Beam splitter Specchio hn

Skoog, West, Holler, Crouch Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nel tempo Cuneo ottico Lettore Cuvetta di riferimento I0 Amplificatore Sorgente Specchio a settori Rivelatore Cuvetta del campione hn Monocromatore I Specchio Specchio a settori Motore Vista frontale Trasparente Specchio Skoog, West, Holler, Crouch

A + B C Titolazioni spettrofotometriche Si misura l’assorbanza di una soluzione ad una lunghezza d’onda opportuna dopo l’aggiunta di incrementi noti di titolante. Celletta per titolazioni spettrofotometriche agitatore foro per buretta finestre di quarzo A + B C A A A eA = eC = 0 eB > 0 eB = eC = 0 eA > 0 eA = eB = 0 eC > 0 V V V

eC = 0 eA > eB > 0 A V eA = 0 eB > eC > 0 eA = 0 eC > eB > 0 Per ridurre l’effetto della diluizione, si impiegano soluzioni concentrate di titolante o si correggono i dati sperimentali: Assorbanza corretta = Assorbanza osservata  Volume totale Volume iniziale

Analisi quantitativa in assorbimento La spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nell’UV è una delle tecniche di più ampio utilizzo nell’analisi quantitativa strumentale. Caratteristiche salienti: Ampia applicabilità Alta sensibilità (fino a 10-7 M) Selettività da moderata ad alta Buona accuratezza Facilità e convenienza

Esempio di applicazione della spettrofotometria in campo biologico Saggi immunologici: si basano sull’uso di anticorpi specifici per l’analita (proteina) SAGGIO IMMUNO-ENZIMATICO ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) L’enzima può trasformare, ad es., un reagente incolore in prodotto colorato (dosaggio colorimetrico) oppure un reagente non fluorescente in prodotto fluorescente (dosaggio fluorimetrico). La quantità di prodotto colorato o fluorescente ottenuto è proporzionale alla concentrazione di analita.

E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza. FLUORIMETRIA E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza. Fluorescenza: processo nel quale gli atomi o le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazioni elettromagnetiche, rilassano allo stato fondamentale cedendo l’eccesso di energia come fotoni. Skoog, West, Holler, Crouch L’emissione di radiazioni fluorescenti avviene a lunghezze d’onda maggiori (frequenza ed energia minori) rispetto alle radiazioni assorbite (spostamento o shift di Stokes)

La fluorescenza è possibile solo in presenza di cromofori con particolare distribuzione dei livelli energetici (fluorofori). Le transizioni elettroniche coinvolte sono sempre le stesse: p p* n p* Molti composti fluorescenti contengono anelli aromatici specie se condensati. La fluorescenza è inoltre particolarmente favorita in molecole rigide. Ad esempio: Trans-stilbene (fluorescente) Cis-stilbene (non fluorescente) Fluoresceina (fluorescente) Fenolftaleina (non fluorescente)

Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente La fosforescenza è un fenomeno simile alla fluorescenza. Per capirne la differenza occorre prendere in considerazione gli stati di singoletto e tripletto: Skoog, West, Holler, Crouch Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente nello stato di singoletto (spin elettronici appaiati). Nello stato eccitato possono assumere invece sia lo stato di singoletto che di tripletto (coppia di spin elettronici spaiati). Fluorescenza singoletto eccitato singoletto fondamentale Transizione probabile e rapida (< 10-5 sec) Fosforescenza tripletto eccitato singoletto fondamentale Transizione poco probabile e più lenta (> 10-3 sec)

Analisi fluorimetrica Spettri di eccitazione: Eccitazione a l variabile Misurazione intensità di fluorescenza a l fissa (di solito lmax) In teoria, spettri di assorbimento e di eccitazione dovrebbero coincidere Spettri di emissione: Eccitazione a l fissa (di solito lmax) Misurazione intensità di fluorescenza a l variabile In genere, spettri di emissione e di eccitazione appaiono come immagini speculari l’uno dell’altro

Skoog, West, Holler, Crouch Esempio: spettro di eccitazione (a) e spettro di emissione (b) dell’antracene in etanolo stato fondamentale eccitato antracene stato fondamentale eccitato Skoog, West, Holler, Crouch

Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza E’ possibile dimostrare che: If = S  F  I0 (1 – 10 –abc) If = intensità radiazione fluorescente I0 = intensità radiazione di eccitazione a = coefficiente di estinzione alla l di eccitazione b = spessore della soluzione (cammino ottico) c = concentrazione della soluzione S = costante di proporzionalità (≤ 1) legata all’efficienza quantica del campione (rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti) F = costante di proporzionalità (≤ 1) legata alla resa strumentale (rapporto tra fotoni misurati e fotoni emessi)

SFI0 If = S  F  I0 (1 – 10 –abc) If = SFI0  abc If = K  c Fattori che determinano la non linearità tra If e concentrazione: diminuzione di I0 nell’attraversamento della soluzione differente assorbimento della stessa radiazione fluorescente in funzione del cammino ottico percorso If = S  F  I0 (1 – 10 –abc) concentrazione SFI0 If Skoog, West, Holler, Crouch Solo per soluzioni molto diluite si ha con buona approssimazione: If = SFI0  abc If = K  c

M* + O2 M + O2* Processi di spegnimento (quenching) Processi nei quali l’emissione da parte di una molecola eccitata diminuisce in intensità a causa del trasferimento di energia ad un’altra molecola (spegnitore o quencher). Lo spegnitore eccitato può quindi dissipare la sua energia attraverso altri processi. Un esempio tipico di quencher è rappresentato da O2 : M* + O2 M + O2* molecola allo stato eccitato tripletto fondamentale singoletto eccitato stato fondamentale Autospegnimento (self-quenching) Una molecola di analita assorbe energia da un’altra molecola di analita eccitata con trasferimento di energia non radiante che alla fine viene dissipata sotto forma di calore. Aumenta con la concentrazione. Autoassorbimento Si verifica quando la l di emissione si sovrappone ad una banda di assorbimento. Aumenta anch’essa con la concentrazione. Nell’analisi quantitativa occorre assicurarsi dell’assenza di quenching!

Fluorimetri e spettrofluorimetri La differenza sta nel selezionatore di radiazioni elettromagnetiche: filtri per i fluorimetri, reticoli di diffrazione per gli spettrofluorimetri. Sorgenti radianti Devono produrre radiazioni di elevata energia (l’intensità di fluorescenza, come già visto, è funzione dell’intensità di eccitazione) concentrata nell’UV: lampade a vapori di Hg o lampade allo xenon. Selezionatori di l Sono normalmente due (filtri o reticoli), uno per il lato di eccitazione e l’altro per quello di emissione. Rivelatori E’ indispensabile l’impiego di fotomoltiplicatori a causa dei bassi livelli di energia tipici dell’emissione fluorescente.

Schema ottico di uno spettrofluorimetro Skoog, West, Holler, Crouch L’emissione fluorescente è prelevata di solito a 90° rispetto al raggio incidente. Vantaggi: rivelazione della sola radiazione di fluorescenza (e non eventualmente di quella di eccitazione) maggiore intensità di fluorescenza emessa dai primi strati della soluzione del campione

Applicazioni della fluorimetria Pur se di uso meno esteso rispetto alla spettrofotometria, la fluorimetria può essere applicata a numerosi composti sia organici che inorganici. Per questi ultimi si ricorre ad agenti complessanti come ad esempio: Skoog, West, Holler, Crouch Vantaggi dell’analisi fluorimetrica: selettività potenzialmente superiore alla spettrofotometria sensibilità superiore alla spettrofotometria ottenuta aumentando la potenza I0 delle radiazioni di eccitazione (limite di rivelabilità 10-8 - 10-9 M) If = S  F  I0 (1 – 10 –abc) mentre A = abc = - log T = - log I0/I