Facoltà di Farmacia Fattori ambientali e crescita dei batteri

Optimum per i batteri tra 6,5 e7,5 FATTORI AMBIENTALI Temperatura Psicrofili Termofili Mesofili Ossigeno Aerobi stretti Anaerobi stretti Anaerobi facoltativi Microaerofili pH Optimum per i batteri tra 6,5 e7,5

Fattori ambientali Grado di umidità (presenza di acqua libera) Terreni liquidi per la crescita in coltura. Terreni solidi con agar al 1,5-2%, con quantità di acqua lasciata libera. Grado di umidità (presenza di acqua libera) Un aumento di pressione osmotica dovuto alla concentrazione salina o degli zuccheri determina una stasi della crescita microbica. I batteri hanno meccanismi di protezione contro gli choc osmotici. Microrganismi osmofili in grado di sopravvivere in particolari condizioni di pressione osmotica (lieviti in presenza di elevate concentrazioni di zucchero) Microrganismi alofili in grado di vivere in presenza di elevate concentrazioni saline (stafilococchi) Le sostanze disciolte in acqua determinano la pressione osmotica

FATTORI AMBIENTALI classificazione e range di tolleranza Psicrofili –7°  20° C optimum 18° C Mesofili 20°  40° C optimum 37°C Termofili > 40° C  90° C optimum diversificato Temperatura Aerobi Anaerobi Anaerobi facoltativi Microaerofili Ossigeno Terreno colturale per batteri a concentrazione idrogenionica  7 Batteri optimum di sviluppo 6,5 7,5 Lieviti e muffe optimum di sviluppo 4,5 6,5 pH

Aerobi obbligati stretti Anaerobi obbligati stretti Necessitano ossigeno (colture con agitazione e aria, es. M. tubercolosis) Anaerobi obbligati stretti L’ossigeno è tossico ( bacteroides intestinali,clostridium ed altri,) Anaerobi facoltativi (germi di interesse medico in flora intestinale, metabolismo sia ossidativo che fermentativo: Vibrio, Escherichia, Klebsiella, Salmonella) Microaerofili (Bassa tensione di ossigeno: < 20%, per sviluppo ottimale – streptococchi e lactobacilli) Ossigeno

Macroelementi e micronutrienti Macroelementi : sono elementi chimici di cui i batteri hanno bisogno in grandi quantità. Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo, Fosforo, entrano nella sintesi di carboidrati e lipidi proteine e acidi nucleici. Inoltre esistono altri quattro elementi essenziali come Calcio (spora), Potassio (enzimi), Magnesio (stabilizza ribosomi e m. cellulari) , Ferro (enzimi). Ognuno di questi elementi ha un ruolo determinante quindi nella vita del cellula batterica. Micronutrienti: elementi la cui presenza è necessaria solo in tracce : manganese, zinco, cobalto, molibdeno, nickel, rame. Le tracce presenti in quantità infinitesimali sulla vetreria, o nei normali terreni di coltura sono sufficienti a garantire la crescita microbica.

Elementi di crescita microbica Il carbonio viene impiegato per la costruzione dello scheletro della cellula, in genere i composti che forniscono carbonio, forniscono anche idrogeno e ossigeno. Le molecole organiche sono una fonte di elettroni, il loro trasferimento lungo specifiche catene di trasporto produce energia, che viene utilizzata per produrre lavoro. Gli elettroni sono necessari anche alla biosintesi, in quanto danno origine alla riduzione delle sostanze per costruire molecole organiche. L’ anidride carbonica è una fonte di carbonio ma non di idrogeno o energia, solo gli autotrofi (per definizione) sono in grado di ridurre la CO2 di utilizzarla cioè come unica e principale fonte di carbonio. Molti microrganismi autotrofi sono fotosintetici e usano la luce come fonte di energia, alcuni ossidano le molecole inorganiche e traggono energia dal trasferimento di elettroni.

Fonti di carbonio energia ed e- Autrofi: la CO2 è l’unica fonte di carbonio per la biosintesi. Eterotrofi: Molecole organiche ridotte derivanti da altri organismi. Energia Fototrofi : luce Chemiotrofi : ossidazione di composti organici o inorganici Elettroni: Litotrofi : molecole inorganiche ridotte. Organotrofi: molecole organiche Energia e metabolismo

Tipi nutrizionali Energia e metabolismo Possono essere distinti in quattro categorie in base alle loro esigenze di carbonio e di energia, In maggioranza i microrganismi finora studiati appartengono agli : Autotrofi fotolitotrofi e eterotrofi chemiorganotrofi. I primi ricavano l’energia dalla luce (foto) e impiegano CO2 per la sintesi i secondi ricavano energia dai c. organici e anche carbonio da composti organici Tutti i microrganismi patogeni appartengono ai chemiorganotrofi. Energia e metabolismo

Azoto, Fosforo, Zolfo Il fosforo è presente negli acidi nucleici nei nucleotidi, in vari cofattori e proteine. Il fosfato inorganico è la fonte di fosforo, in molti ambienti acquatici la sua mancanza rappresenta un fattore limitante la crescita. L’ azoto è importante per la sintesi di proteine e carboidrati, purine e pirimidine tutti costituenti la cellula batterica. Molti microorganismi utilizzando direttamente l’ammoniaca per ricavare azoto, una vasta gamma di organismi riducono l’azoto atmosferico. Lo zolfo è importante per la sintesi di alcune sostanze quali metionina e cisteina, carboidrati come biotina e tiamina, come fonte viene usato il solfato.

Fattori di crescita I microrganismi si riproducono quando hanno a disposizione minerali, energia, carbonio, azoto, fosforo e zolfo In genere i microorganismi a partire da questi elementi sono in grado di risolvere tutte le loro esigenze nutrizionali Molto spesso mancando di uno o più enzimi hanno bisogno di assorbire dall’esterno alcuni elementi necessari (enzimi) o i loro precursori. Questi elementi si definiscono fattori di crescita : aminoacidi (biosintesi delle proteine), purine e pirimidine (DNA), vitamine (sintesi).

Assunzione di sostanze dall’ambiente esterno Il primo passo per l’assimilazione dei nutrienti è il loro assorbimento da parte della cellula microbica. I meccanismi devono essere specifici, devono essere assorbite le sostanze necessarie e non altre. Devono essere in grado di trasportare il nutriente al proprio interno quindi contro gradiente di concentrazione. Le molecole di nutrienti devono esser in grado di passare la membrana citoplasmatica che notoriamente è di tipo selettivo.

Assunzione dei nutrienti Diffusione passiva o diffusione: (glicerolo): processo in cui le molecole si spostano da una regione ad alta concentrazione ad una con bassa concentrazione per effetto dell’agitazione termica. Diffusione facilitata : diffusione che avviene in presenza di particolari proteine (carrier) chiamate anche permeasi incluse nella membrana citoplasmatica. La velocità di diffusione in questo caso aumenta . Le proteine di trasporto sono in questo caso simili agli enzimi, ogni carrier trasporta solo una ben determinata tipologia di sostanza. Non richiede alcuna tipologia di energia metabolica. Trasporto attivo : meccanismo che permette il movimento contro gradiente di concentrazione, cioè in direzione di concentrazioni più alte. Differisce dalla diffusione facilitata in quanto utilizza energia metabolica per il trasporto delle sostanze all’interno della cellula.

Figura 4. 1 Diffusione passiva e diffusione facilitata Figura 4.1 Diffusione passiva e diffusione facilitata. Dipendenza del tasso di diffusione dal gradiente di concentrazione del soluto (il rapporto tra concentrazione extra- e intracellulare). Si noti l’effetto di saturazione – evidenziato dal plateau nel grafico – che si verifica al di sopra di uno specifico valore del gradiente, nel caso di diffusione facilitata da una proteina carrier. L’effetto di saturazione si osserva ogni volta che nel trasporto è coinvolto un carrier.

Figura 4. 2 Modello della diffusione facilitata Figura 4.2 Modello della diffusione facilitata. La proteina di membrana con funzione di carrier può cambiare conformazione in seguito al legame con una molecola di soluto esterna, che poi viene rilasciata all’interno della cellula. Successivamente la proteina riacquista la forma originale, orientata verso l’esterno, ed è pronta a legare un’altra molecola di soluto. Poiché il tutto avviene senza apporti di energia, il soluto continuerà a penetrare soltanto finché la concentrazione esterna resterà superiore a quella interna.

I sistemi di trasporto attivo utilizzano proteine di membrana come carrier e ATP come fonte di energia per concentrare le sostanze trasportandole contro gradiente di concentrazione

Coltivazione dei batteri Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio. Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono. Tali informazioni hanno consentito di sviluppare numerosi terreni o mezzi per la loro coltura.

Preparazione dei terreni colturali Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O. Determinazione del pH ed eventuale correzione. Distribuzione in contenitori idonei. Sterilizzazione.

Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio Stato fisico: liquido; semisolido (+Agar 0,5%); solido (+Agar 2%).

Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio L’agar è un polimero composto principalmente di D - galattosio, lo si ottiene di solito dalle alghe rosse è un ottimo agente solidificante perché dopo essere stato sciolto in acqua bollente può raffreddare a 42°C, prima di solidificare e poi liquefa a 80° - 90°C. Non può essere degradato dai microrganismi non ha caratteristiche di nutriente. Un terreno liquido può essere reso solido mediante l’aggiunta di agar 1-2 % il più delle volte 1,5%.

Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio Terreni sintetici (terreni di cui è nota la quantità di ogni singolo componente, spesso a scopo di ricerca è necessario conoscere quello che i batteri metabolizzano). Terreni complessi (si ignora la loro composizione clinica, utili poiché le necessità di un batterio sono sconosciute è quindi impossibile preparare un terreno definito).

Terreni usati in batteriologia Terreni arricchiti: sono aggiunti di altre sostanze come sangue, siero ed emoglobina al fine di favorire la crescita di batteri eterotrofi esigenti . Brodo selenite per isolare salmonelle e shigelle da campioni di feci. Terreni selettivi: terreni arricchiti con Sali biliari o coloranti come fucsina basica favoriscono la crescita dei gram negativi sfavorendo i gram postivi. Agar Endo, EMB (agar all’ eosina e Blu di metilene) e l’agar Mac Conkey che contengono coloranti che inibiscono la crescita dei Gram + mentre MSA inibisce la crescita di batteri diversi dagli stafilococchi). Anche il terreno Sabouraud può essere considerato un terreno selettivo per il pH e il contenuto in zuccheri. Terreni differenziali: mettono in evidenza la presenza di particolari generi batterici sfruttando un colorante e il lattosio che fermentando abbassa il pH provocando il viraggio del colorante, la colonia diviene rossa, i gram negativi gastro intestinali patogeni non fermentano il lattosio e vengono identificati facilmente . L’agar sangue evidenzia batteri in grado di produrre una lisi dei globuli rossi con diverse forme di emolisi. (Beta emolisi, alfa emolisi, gamma emolisi). Terreni di saggio (ad esempio per antibiotici, disinfettanti).

Terreni di coltura Terreni di trasporto Terreni ricchi Conservazione temporanea del microrganismo, non contiene metaboliti essenziali al metabolismo microbiale. Terreni di trasporto Contengono particolari fattori di crescita che permettono la replicazione della maggior parte dei batteri di interesse medico compresi i patogeni più esigenti, agar sangue agar cioccolato. Terreni ricchi Terreni di arricchimento Contengono un fattore che favorisce selettivamente la crescita di un particolare microrganismo come ad es. il brodo-selenite che favorisce la crescita dei gram negativi. Terreni selettivi Terreni solidi che contengono sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni generi batterici consentendo la più crescita di altri. EMB, MSA, Sabouraud. Contengono sostanze che consentono di sfruttare il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra specie di microrganismi differenti. Per i batteri gram negativi Agar Mac Conkey. (diventa rosso al di sotto di ph 6,8). Lattosio positivi di colore rosso. Terreni differenziali

Terreni di coltura complessi Non è nota l’esatta percentuale dei singoli ingredienti presenti Brodo nutritivo : TSB (Triptic soy broth) Agar nutritivo: TSA (Triptic soy agar) Agar sangue Agar cioccolato Agar Mac Conkey

Colture pure e caratteri colturali I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un terreno di laboratorio, sono chiamati coltura. Per coltura pura si intende una coltura costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un’unica cellula madre. Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio. Coltura mista: la popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche abitano normalmente varie parti del nostro corpo (orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).

Caratteristiche colturali Il modo in cui le colonie batteriche si sviluppano sulla superficie dell’agar è importante nella identificazione dei batteri sia per la dimensione che per l’aspetto. Un corretto piastraggio di una popolazione mista può portare al riconoscimento e all’identificazione di una specie batterica. In natura i batteri crescono sulle superfici in forma di biofilm ma a volte formano colonie distinte, di norma la crescita batterica è rapida ai margini della colonia e molto più lenta al centro. In alcune colonie la porzione centrale va incontro ad autolisi, ai margini infatti ossigeno e nutrienti sono abbondanti rispetto al centro.

Variazioni rilevabili a occhio nudo nella morfologia delle colonie, forma e andamento generale del suo margine vengono rilevati osservando la colonia dall’alto, lo spessore si rileva osservando la colonia di lato, tenendo la piastra all’altezza degli occhi.