Corso elettivo “Farmaci, integratori e doping” Facoltà di Scienze Motorie Università degli Studi di Verona Corso elettivo “Farmaci, integratori e doping” Lezioni 5 e 6: Le sostanze dopanti -2- Docenti: C. Chiamulera, G. Fumagalli, R. Leone

Eritropoietina (EPO) Come è noto i globuli rossi (GR) trasportano l’ossigeno ai tessuti e negli sport di resistenza, ad esempio ciclismo, sci di fondo, ecc., le richieste di ossigeno sono molto elevate Da tempo, pertanto, sono state indagate strategie per aumentare la produzione dei GR in modo da migliorare la performance sportiva La più recente strategia è basata sul ruolo dell’eritropoietina nello stimolare il midollo osseo a produrre globuli rossi (GR) Come doping si usa la EPO ricombinante umana (rHuEPO) e sostanze affini (es. darbepoietina) L’EPO ha una vita relativamente breve nell’organismo mentre il suo effetto stimolante può durare fino a due settimane

Storia dell’eritropoietina 1905 Carnot e Deflandre ipotizzarono che un fattore umorale, che chiamarono emopoietina, regolava la produzione di globuli rossi 1936 Hjort dimostrò e confermò l’esistenza di questo fattore 1950 Reissmann dimostrò che l’espressione genica del fattore era regolata dalla pressione d’ossigeno 1977 Miyake riuscì a purificare l’eritropoietina umana 1985 Lin e Jacobs clonarono il gene dell’eritropoietina e svilupparono una linea cellulare transfettata (cellule CHO) capace di produrre eritropoietina ricombinante umana 1989 clonazione del recettore dell’EPO 2000 sintesi della darbepoetina

Livelli ossigeno ematico normali Eritropoiesi Squilibrio Stimolo iniziale Livelli ossigeno ematico normali Ipossia per: diminuito numero GR, diminuita disponibilità di O2 nel sangue, o aumentata domanda tissutale di O2 Squilibrio Aumentata capacità del sangue di trasportare O2 L’eritropoietina stimola il midollo osseo Rene (e fegato a un grado minore) rilasciano eritropoietina L’aumentata eritropoiesi incrementa il numero dei GR

Eritropoiesi ed ipossia L’eritropoiesi è controllata da un sistema a feedback molto sensibile, in cui un sensore a livello del rene percepisce le alterazioni nell’apporto di ossigeno Il meccanismo si basa sulla presenza di un fattore di trascrizione (Hypoxia-inducible factor, HIF-1) eterodimerico (HIF-1α e HIF-1β) che aumenta l’espressione del gene dell’eritropoietina HIF-1α è instabile in presenza di ossigeno e viene rapidamente degradato dalla prolil-idrossilasi con il contributo della proteina di von Hippel-Lindau Durante ipossia la propil-idrossilasi è inattiva di conseguenza HIF-1α si accumula attivando l’espressione dell’eritropoietina che stimola la rapida espansione dei progenitori eritroidi

Eritropoietina umana L’eritropoietina è una proteina composta da 193 aminoacidi (ma i primi 27 sono scissi durante la secrezione) Viene prodotta principalmente dalle cellule interstiziali peritubulari del rene, sotto il controllo di un gene situato sul cromosoma 7 Dopo la secrezione l’eritropoietina, a livello del tessuto emopoietico (midollo osseo), si lega ad un recettore (EPO-R) localizzato sulla superficie dei progenitori eritroidi e viene internalizzata In presenza di anemia o ipossiemia la sintesi di EPO cresce rapidamente di più di 100 volte e conseguentemente aumenta la sopravvivenza, proliferazione e maturazione delle cellule progenitrici midollari anche attraverso l’inibizione dell’apoptosi (morte cellulare programmata)

Midollo osseo Staminali Eritroblasti BFU-E CFU-E Reticolociti Globuli rossi Trasporto di ossigeno Sensore Cellule produttrici EPO RENE BFU-E = unità formanti aggregati-eritrociti; CFU-E = unità formanti colonie-eritrociti

Recettore dell’eritropoietina (EPO-R) Membrana cellulare JAK2= Janus chinasi 2 La modificazione conformazionale determinata dal legame dell’EPO con il recettore attiva JAK2 che si auto-fosforilizza e che insieme ad altre proteine attivate determina gli effetti biologici dell’EPO

Segnali intracellulari attivati dall’EPO Epo R JaK 2 Stat 5 Epo Jak 2 Ras Grb 2 MEK PI3 K PKB/Akt CREB Erk Segnali intracellulari attivati dall’EPO Sopravvivenza cellulare Proliferazione Differenziamento

Eritropoietina umana I livelli normali di EPO nel sangue sono circa 2-25 mU/ml, ma possono aumentare di 100-1000 volte come risposta all’ipossia Il meccanismo a sensore d’ossigeno porta ad interrompere la produzione di EPO quando il numero dei GR e/o la fornitura di ossigeno ai tessuti ritorna all’equilibrio Il meccanismo a feedback assicura una produzione adeguata di GR per prevenire l’anemia e l’ipossia tissutale, ma non troppo elevata da portare a policitemia con eccessiva viscosità del sangue e conseguenti rischi cardiovascolari La sovraproduzione di EPO che porta a policitemia (secondaria da distinguere dalla policitemia vera o primaria: disordine mieloproliferativo dove proliferano cloni, indipendenti dall’EPO, di cellule progenitrici con incremento sia di GR che di granulociti e piastrine) può derivare da patologie cardiache o repiratorie, dall’altitudine, da ostruzioni del flusso sanguigno al sito di produzione dell’EPO, da tumori producenti EPO Nella policitemia secondaria i livelli di EPO sono in genere elevati, ma possono anche essere nella norma per aumento del suo turnover

Eritropoietina umana E’ noto che le differenze genetiche esistenti tra gli atleti possono essere un elemento alla base delle diverse capacità di prestazione Tra le possibili differenze genetiche alcune possono riguardare l’eritropoiesi in generale e specificatamente l’eritropoietina Un esempio è la storia del fondista finnico Eero Mäntyranta, doppia medaglia d’oro alle Olimpiadi del 1964 ad Innsbruck Era nato con una mutazione genica dell’Epo (espressa a livello recettoriale) che aumentava del 25-50% la sua capacità di trasporto di O2 con i GR Tale condizione parafisiologica potrebbe essere riprodotta attraverso manipolazione genica

EERO  MÄNTYRANTA Naturally Rich Blood

Formazione dei globuli rossi 0-2 % Maschi <17 g/dl Femine <16 g/dl

Eritropoietina umana Il numero dei recettori per l’EPO varia nelle diverse cellule della linea eritrocitaria. Il massimo si ha nelle CFU-E, il numero diminuisce con il progredire del differenziamento e della maturazione delle cellule eritrocitarie. Gli eritrociti maturi sono privi di recettori per l’EPO Recettori per l’EPO sono stati individuati anche sui miociti, sulle cellule endoteliali, nel SNC, ovaio e testicoli L’EPO, pertanto, si pensa abbia un ruolo fisiologico nello sviluppo del cuore e del cervello L’EPO protegge i tessuti cardiaci e nervosi dall’infiammazione e dal danno ischemico: sia attraverso la stimolazione diretta delle cellule nervose e cardiache che indirettamente mobilizzando cellule progenitrici endoteliali promuovendo, così, la neo-vascolarizzazione

EPO e SNC Buemi M et al. Clinical Science 2002; 103:275–282

Eritropoietine esogene Eritropoietina ricombinante umana (epoietina, rHuEPO) Presenta solo lievi differenze (a livello delle catene di carboidrati) rispetto all’EPO fisiologica, che tuttavia si riflettono sul comportamento chimico e fisico della molecola, ad esempio vi sono differenze nella carica elettrica Ai fini ergogenici la rHuEPO viene utilizzata con somministrazioni iniettabili ogni 2-3 gg, per 3-4 settimane, associata a preparati di Ferro. Infatti, In condizioni di stimolazione da eritropoietina, diventa necessario fare sintetizzare l’emoglobina negli atleti ad un ritmo molto più elevato che di norma e ciò necessita di un adeguato rifornimento di ferro per mantenere l’efficienza eritropoietica. Emivita e.v. 8,5 ore Raggiunta la fase di mantenimento l’assunzione può avvenire a dosi più basse, di più difficile individuazione ai controlli antidoping Darbepoietina Più stabile dell’EPO, con emivita più prolungata (e.v. 25,3 ore) e maggiore efficacia; è più facilmente identificabile per caratteristiche strutturali diverse dal prodotto umano endogeno e per la minore clearance

Usi terapeutici dell’eritropoietina (epoetina; Eprex®, Globuren®, Neorecormon®; darbepoetina: Aranesp®, Nespo®) Anemia in corso di insufficienza renale cronica Anemia da zidovudina (anti-HIV) Anemia "refrattaria" Anemia post-chemioterapia antitumorale Carenze patologiche di EPO Mieloma Sindromi mielodisplasiche

La ricerca sull’ eritropoietina in rapido e continuo sviluppo Prodotti che mimano l’attività dell’EPO Piccoli peptidi o composti non peptidici che possono legarsi, attivandoli, ai recettori dell’EPO (Science 1996; 273:458. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:12156) Recentemente, ad esempio, in esperimenti in vitro, è stato dimostrato che l’emolinfa del baco da seta inibisce l’apoptosi di cellule che producono EPO incrementando la produzione dell’EPO di 5 volte (Biotechnol Bioeng 2005; 91:793)

I problemi dei test per l’EPO Misure indirette per l’EPO Misura della densità dei GR (ematocrito espresso in percentuale), dei livelli di emoglobina, conta dei reticolociti Nel ciclismo misurazioni dell’ematocrito superiori al 50% portano alla sospensione. Valori superiori al 50% vengono ritenuti sospetti dal CIO La Federazione Internazionale di Sci ha imposto un limite di emoglobina di 18,5 g/dL nell’uomo e di 16,5 g/dL nella donna, se riscontrati prima di una gara l’atleta non può partecipare per preservare la sua salute Bisogna sottolineare che i valori di ematocrito ed emoglobina possono variare da atleta ad atleta e in risposta allo stesso esercizio. L’ideale è avere il profilo ematologico nel tempo di ciascun atleta

I problemi dei test per l’EPO Le indagini per individuare l’uso di EPO si sono estese a diversi sport ed ovviamente alle Olimpiadi Marco Pantani fu squalificato dal Giro d’Italia per un valore di ematocrito del 52 % Nel 2003 il mezzofondista keniano Bernard Lagat (secondo miglior tempo di sempre nei 1500 m) è risultato positivo (ricerca di rHuEPO nelle urine) per assunzione di EPO prima dei Campionati del Mondo di atletica leggera di Parigi (a cui non ha potuto partecipare) le successive contro-analisi lo hanno però scagionato. Questo caso ha dimostrato la necessità di ricercare test più attendibili. Recentemente è stato messo a punto (con buoni risultati) un nuovo metodo isoelettrico, diretto, per distinguere l’EPO esogena dall’endogena nei campioni di urine, sviluppato nel laboratorio francese di Chatenay-Malabry (Nature 2000; 405:635; Anal Biochem 2002; 311:119; Clin Chem 2003; 49:901). Si è riusciti ad individuare EPO esogena anche dopo 3 giorni dall’assunzione

Reazioni avverse da eritropoietina esogena Ipertensione arteriosa (Incidenza 1-30%. Il meccanismo non è del tutto chiarito, l’EPO ha un’azione vasocostritrice inoltre l’esposizione cronica provoca resistenza all’azione vasodilatatrice dell’ossido nitrico. Infine, l’EPO promuove la crescita delle cellule muscolari lisce dei vasi con rimodellamento vascolare e ipertrofia che può contribuire al mantenimento dell’ipertensione [Am J Kidney Dis 1999; 33:821-8]) Dolore osseo (non grave, transitorio, incidenza elevata = 40%) Convulsioni (per rapido incremento viscosità del sangue e perdita vasodilatazione ipossica con conseguente aumento resistenze vascolari) Cefalea Fenomeni tromboembolici (EP, IMA, ictus), tutti legati all’iperviscosità ematica Anemia post-trattamento per diminuita produzione EPO endogena Aplasia pura della serie rossa (formazione anticorpi anti-EPO?) Disordini mieloproliferativi (studi su animali, trattamenti a lungo termine?)

Danni da eritropoietina come doping I dati sulle reazioni avverse dell’eritropoietina elencate in precedenza derivano quasi esclusivamente dai trattamenti terapeutici su pazienti con patologie sottostanti Non ci sono studi sul danno dell’eritropoietina usata come doping su atleti sani Uno studio su atleti a cui fu data EPO per 6 settimane ha evidenziato un significativo incremento della pressione sistolica in risposta ad esercizio sub-massimale Il numero di morti tra ciclisti belgi e olandesi tra il 1987 e il 1990 è stato messo in relazione all’uso di EPO (Gambrell e Lombardo. Drugs and doping: blood doping and recombinant human erythropoietin. In: Mellion, M.B. (ed.): Sports medicine secrets. Philadelphia: Hanley & Belfus, 1994, pp. 130-3) Non è sbagliato pensare che le reazioni avverse evidenziate nei pazienti possano verificarsi anche negli atleti sani anche se con un incidenza inferiore

Correlazione emoglobina - potenza 591.5 93.7 54.7 18.2 578.5 53.5 17.8 552.5 51.1 17.0 526.5 48.6 16.2 487.5 45.0 15.0 455.0 42.0 14.0 422.5 39.0 13.0 416.0 38.4 12.8 Watt MCV Htc Hb (Gentilmente fornita da E. Capodacqua, giornalista Repubblica)

Simulazione teorica (ma non troppo) 45.872 - 8’14’’ 1h 05’24’’ 18.2 45.512 - 7’43’’ 1h 05’55’’ 17.8 44.776 - 6’38’’ 1h 07’00’’ 17.0 44.042 - 5’31’’ 1h 08’07’’ 16.2 42.857 - 3’38’’ 1h 10’00’’ 15.0 41.831 - 1’55’’ 1h 11’43’’ 14.0 40.742 - 42” ’’ 1h 13’38’’ 13.0 40.522 0.0.00 1h 14’20’’ 12.8 Km/h Distacco Tempo Hb gr/dL (Gentilmente fornita da E. Capodacqua, giornalista Repubblica)

L’EPO e gli sbalzi nel sangue : un esempio concreto nello sci di fondo Valori di Htc di un atleta di spicco dello sci di fondo, stagioni ’93-’95 (Dati processo di Ferrara) (Gentilmente fornita da E. Capodacqua, giornalista Repubblica)

Nel ciclismo lo stesso su e giù Valori di Htc di un atleta di spicco del ciclismo durante le stagioni 1994 e 1995 (Dati processo di Ferrara) (Gentilmente fornita da E. Capodacqua, giornalista Repubblica)

Il processo di Ferrara: l’altalena di HTC e HB Min Max Diff % Diff.% M.Albarello 14,5 18,6 28,3 44,0 57,5 30,7 G.Bontempi 13,9 20,1 44,7 40,1 62,0 54,6 G.Bugno 15,2 17,6 15,8 51,8 15,9 C.Chiappucci 12,0 19,8 65,0 35,7 60,7 70.0 M.De Zolt 14,3 23,1 40,6 54,2 33,5 M.Pantani 13,7 35,8 40,7 57,4 41,0 M. Di Centa 13,0 18,0 38,5 41,2 55,5 34,7 M.Fondriest 31,4 40,8 53,9 32,1 (Gentilmente fornita da E. Capodacqua, giornalista Repubblica)

Doping ematico Prima dell’EPO si utilizzava la tecnica delle trasfusioni di sangue per incrementare il numero di globuli rossi L’EPO ha rimpiazzato le trasfusioni in quanto determina un maggiore aumento di GR. Negli ultimi tempi, tuttavia, ci sono segnali di un ritorno alle autotrasfusioni in quanto non individuabili nei test Effetti simili a quelli dell’EPO e del doping ematico si possono ottenere anche con gli allenamenti in altura e con le tende ipo-ossigenate

Doping ematico In Italia, questa tecnica nasce a Ferrara nella prima metà degli anni 80 (1984: F. Moser record dell’ora) con l’autoemotrasfusione

Doping ematico Due possibilità: Doping ematico omologo (sangue proveniente da un’altra persona) Sangue e sostituti plasmatici utilizzati in medicina ”Donor Doping” (generalmente compagni di squadra) Doping ematico autologo (autotrasfusione) Estrazione di es. 900 ml sangue - 5 sett. prima della gara Infusione del sangue centrifugato (cellule impaccate) 1 o 2 giorni prima della gara Con le trasfusioni si può incrementare la massa eritrocitaria del 20%

Vantaggi e svantaggi del doping ematico autologo “Nessun metodo di detenzione” Evitare patologie tipo AIDS ed epatiti Evitare reazioni da sangue non compatibile Svantaggi Diminuita performance durante l’allenamento dopo l’estrazione del sangue

Vantaggi e svantaggi del doping ematico omologo Nessuna diminuzione della performance Svantaggi Possibilità di essere individuati!!! (individuazione degli antigeni minori dei GR del donatore) Contrarre malattie dal donatore Reazioni da trasfusione

Soggetti trattati con Aranesp® Doping ematico autologo (~ 1L) Atleta ”pulito” Scientific evidense support the FIS results. A study treating healthy young subjects with Aranesp gives a blood pattern identical to that of the presented positive skiers. More importantly, a new and under revision study of autologous blood doping also mimics the pattern of a blood stimulating treatment. In fact monitoring Hb values and reticulocytes obviosly may give valuable information of blood manipulations in all its forms. Soggetti trattati con Aranesp® C. Lundby & R. Damsgaard. Scand J Med Sci Sports 2005 Doping ematico autologo (~ 1L) SP Mortensen, et al.. J Physiol. 1st revision

Effetti del doping ematico su VO2max e fatica

Performance dopo doping ematico

Altre tecniche per aumentare la disponibilità di O2 nel sangue I trasportatori di ossigeno come i perfluorocarburi (PFC), particelle inerti in forma di emulsioni, possono aumentare la concentrazione o la disponibilità di ossigeno arterioso per i muscoli, senza aumentare la concentrazione di emoglobina e/o il numero dei globuli rossi circolanti. I PCF sono capaci di aumentare la concentrazione di ossigeno disciolto come gas (senza quindi utilizzare l’emoglobina dell’organismo) con effetto praticamente immediato dopo la somministrazione e con successiva rapida eliminazione per via respiratoria. Le controindicazioni e i rischi non sono del tutto conosciuti. Tuttavia sono state registrate le seguenti reazioni avverse: Incremento temperatura corporea (oltre 40°C) Diarrea Tossicità renale, epatica e polmonare Infezioni ematologiche batteriche con prodotti contaminati Tromboembolia

Altre tecniche per aumentare la disponibilità di O2 nel sangue Le emoglobine di varia origine (umana, bovina, prodotta attraverso tecniche di ingegneria genetica) variamente modificate per renderle più stabili e meno tossiche possono essere conservate, a differenza del sangue, per un lungo periodo. Queste emoglobine di sintesi non sono rintracciabili nelle urine, ma sono identificabili esclusivamente nel sangue, purché il prelievo del campione venga effettuato praticamente a ridosso della gara (poche ore prima o poche ore dopo). Si tratta infatti di sostanze che vengono rapidamente eliminate dal circolo sanguigno entro 12-24 ore al massimo.

Un test per individuare l’uso dei trasportatori di O2 (HBOC) Lasna F. et al. Clinical Chemestry 2004; 50:410-5 Usando un metodo eletroforetico gli Autori del lavoro sono riusciti ad individuare i seguenti prodotti HBCO in campioni di sangue: Hemopure (Hb bovina glutaraldeide-polimerizzata) PolyHeme (Hb umana piridossalata glutaraldeide-cross-linked) PHP (Hb umana piridossalata poliossietilene coniugata Hemospan (Hb umana maleimide-polietilene-glicol-coniugata HemAssist (Hb umana diaspirina-cross-linked Ossiglobina Con questo metodo si è riusciti a individuare Hemopure fino a 3-4 g dopo l’assunzione (al 5 giorno 11/12 campioni debolmente positivi)

Modificatori allosterici dell’emoglobina Rientrano tra le sostanze dopanti anche quei prodotti che consentono di modificare allostericamente l’emoglobina al fine di aumentare il rilascio di ossigeno della stessa a livello periferico Esempio i modificatori allosterici della serie RSR (2-[4-[(3.5 diclofenilcarbomoil)metil]-2-metil-propionato), il 2-3-difosfoglicerato e il metil-acetil-fosfato.

Gli stimolanti del SNC

Slide 2: Brain regions and neuronal pathways Certain parts of the brain govern specific functions. Point to sensory, motor, association and visual cortex to highlight specific functions. Point to the cerebellum for coordination and to the hippocampus for memory. Indicate that nerve cells or neurons travel from one area to another via pathways to send and integrate information. Show, for example, the reward pathway. Start at the ventral tegmental area (VTA) (in magenta), follow the neuron to the nucleus accumbens, and then on to prefrontal cortex. Explain that this pathway gets activated when a person receives positive reinforcement for certain behaviors ("reward"). Indicate that you will explain how this happens when a person takes an addictive drug.

La via del “piacere” Gli stimolanti (es. cocaina, oppioidi, amfetamine,cannabinoidi) alterano le aree cerebrali che mediano le sensazioni di motivazione e di piacere

Meccanismo comune agli stimolanti: liberazione di dopamina

Meccanismo comune agli stimolanti: liberazione di dopamina

Meccanismo comune agli stimolanti: liberazione di dopamina

Meccanismo comune agli stimolanti: liberazione di dopamina

Stimolanti del SNC Cocaina Derivata dalla pianta Erythroxylon coca è un potente stimolante del SNC, agisce inibendo il reuptake della dopamina a livello delle sinapsi. Provoca euforia, fiducia in se stessi, potenza sessuale, non fa sentire la fatica, mantiene sveglie aumenta l’attenzione. Provoca aritmie cardiache, infarto del miocardio, ipertensione o ipotensione, ansia, depressione, attacchi di panico, aggressività, irritabilità, psicosi tossiche, tremori, convulsioni, alterazione dei riflessi, mancata coordinazione motoria, paralisi muscolare, respirazione irregolare dipendenza, morte

Slide 12: Dopamine binding to receptors and uptake pumps in the nucleus accumbens Explain that cocaine concentrates in areas of the brain that are rich in dopamine synapses. Review dopamine transmission in the nucleus accumbens. Point to dopamine in the synapse and to dopamine bound to dopamine receptors and to uptake pumps on the terminal.

Slide 13: Cocaine binding to uptake pumps; inhibition of dopamine uptake Now, show what happens when cocaine is present in the synapse. Cocaine (turquoise) binds to the uptake pumps and prevents them from removing dopamine from the synapse. This results in more dopamine in the synapse, and more dopamine receptors are activated.

Modificazioni nell’attività cerebrale dopo cocaina Synapse 1993;14:169-77 Slide 8: Long-term effects of drug abuse. This PET scan shows us that once addicted to a drug like cocaine, the brain is affected for a long, long time. In other words, once addicted, the brain is literally changed. Let’s see how...   In this slide, the level of brain function is indicated in yellow. The top row shows a normal-functioning brain without drugs. You can see a lot of brain activity. In other words, there is a lot of yellow color. The middle row shows a cocaine addict’s brain after 10 days without any cocaine use at all. What is happening here? [Pause for response.] Less yellow means less normal activity occurring in the brain—even after the cocaine abuser has abstained from the drug for 10 days. The third row shows the same addict’s brain after 100 days without any cocaine. We can see a little more yellow, so there is some improvement— more brain activity—at this point. But the addict’s brain is still not back to a normal level of functioning. . . more than 3 months later. Scientists are concerned that there may be areas in the brain that never fully recover from drug abuse and addiction. Photo courtesy of Nora Volkow, Ph.D. Volkow ND, Hitzemann R, Wang C-I, Fowler IS, Wolf AP, Dewey SL. Long-term frontal brain metabolic changes in cocaine abusers. Synapse 11:184-190, 1992; Volkow ND, Fowler JS, Wang G-J, Hitzemann R, Logan J, Schlyer D, Dewey 5, Wolf AP. Decreased dopamine D2 receptor availability is associated with reduced frontal metabolism in cocaine abusers. Synapse 14:169-177, 1993.

Mortalità da cocaina: meccanismi

Narcotici (termine non corretto) Oppioidi Agiscono sui recettori µ, κ e δ, il loro principale effetto è quello analgesico. Danno euforia. Non aumentano la performance ma anzi la deprimono. L’uso tra gli atleti è di tipo voluttuario Vengono utilizzati nello sport anche per consentire l’attività dopo traumi che causano ancora dolore Provocano stipsi, depressione respiratoria, nausea e vomito, miosi, edema polmonare, debolezza muscolare, ritenzione urinaria, sonnolenza, dipendenza, morte. Non facendo percepire il dolore possono aggravare il trauma esistente

Stimolanti del SNC Amfetamine La prima amfetamina è stata sintetizzata nel 1887. Consentono un rendimento più elevato e allontanano la soglia della stanchezza. Aumentano la temperatura corporea, il battito cardiaco e la pressione sanguigna. Danno euforia, stimolando alcune aree del cervello, aumentano l’aggressività, la concentrazione e l’attenzione. Diminuiscono l’appetito. Vengono utilizzate dagli atleti poco prima della competizione (gli effetti ricercati si evidenziano a breve termine e non con uso cronico) Sono probabilmente le sostanze che hanno provocato più morti nella storia del doping a causa delle gravi reazioni avverse (vedi oltre) Efedrina, pseudoefredina, fenilpropanolamina Farmaci utilizzati nel raffreddore (ma anche illegalmente come anoressizanti) hanno effetti simili alle amfetamine (anche come reazioni avverse) quando impiegati a dosaggi elevati

Reazioni avverse da amfetamine Anoressia Cefalea Impazienza Insonnia Irritabilità Movimenti inc. Nausea Palpitazioni Tremori Vertigini Vomito Allucinazioni Aggressività Angina pectoris Collasso circolatorio Confusione Convulsioni Delirio Emorragia cerebrale Infarto del miocardio Ipertensione arteriosa Paranoia Dipendenza Disturbi comportamentali Delirio paranoide Discinesia Neuropatie Perdita di peso Psicosi Effetti acuti o a rapida insorgenza Effetti da uso cronico Moder. gravi Gravi

Modificazioni nell’attività cerebrale dopo amfetamine Slide 9: Drugs have long-term consequences.   Here is another example of what science has shown us about the long-term effects of drugs. What this PET scan shows us is how just 10 days of drug use can produce very dramatic and long-term changes in the brain of a monkey. The drug in these images is amphetamine, or what some people call “speed.” Remember the previous slide showed us what the brain of a chronic cocaine abuser looks like. This slide shows us what using a drug like amphetamine can do in only 10 days to the brain of a monkey. This slide also gives us a better idea of what methamphetamine, a drug similar in structure, can do to the brain. Methamphetamine use is becoming increasingly popular in certain areas of the country. The top row shows us, in white and red, normal brain activity. The second row shows us that same brain 4 weeks after being given amphetamine for 10 days. There is a dramatic decrease in brain activity. This decreased brain activity continues for up to 1 year after amphetamine use. These continuous brain changes often trigger other changes in social and emotional behavior, too, including a possible increase in aggressiveness, feelings of isolation, and depression. Photo courtesy of NIDA from research conducted by Melega WP, Raleigh MJ, Stout DB, Lacan C, Huang SC, Phelps ME. Recovery of striatal dopamine function after acute amphetamine- and methamphetamine­induced neurotoxicity in the vervet monkey. Brain Res 1997 Aug 22;766(1-2);113-120. Brain Res 1997; 766:113-120

Caffeina Stimolante del SNC Controversi gli effetti sulla performance La WADA non l’inserisce più tra le sostanze vietate (prima lo era per valori urinari superiori a 12 mcg/ml) Migliora l’attenzione, accorcia i tempi di reazione provoca diuresi, fa sentire meno o ritarda l’affaticamento Provoca dispepsia, danni cardiaci, disidratazione, la combinazione con altri stimolanti SNC può anche essere fatale

Influenze della caffeina che possono portare a migliorare la performance, ma anche a danni Sistema Nervoso Centrale Cuore Muscoli scheletrici Mobilizzazione glucosio e grassi

Meccanismo attraverso cui la caffeina può incrementare la mobilizzazione dei grassi

Cannabinoidi Marijuana, hashish Presenti nella lista WADA Il principale principio attivo è il tetraidrocannabinolo (THC) Uso di tipo voluttuario. Molti atleti usano i THC come miorilassanti e ipnoinducenti Alcuni studi mostrano un maggior uso negli atleti maschi rispetto ai non atleti, l’inverso per le femmine Più che migliorare possono peggiorare la prestazione sportiva Possono provocare percezione distorta, sindromi amotivazionali, paranoia, disturbi psicomotori, tachicardia, cefalea, diminuire il testosterone quando usati a lungo, tipici problemi respiratori da fumo

La cannabis indica La canapa indiana (cannabis indica) è una pianta originaria dell’Asia Centrale, delle zone tropicali e temperate, ma ormai è coltivata in tutto il pianeta. Dalla canapa indiana si estraggono la marijuana e l’hashish. Si ipotizza che l’uso della canapa indiana è iniziato in età neolitica nei territori dell’attuale Afghanistan. Da qui si sarebbe diffuso verso la Cina, dove il suo uso come sedativo è documentato in un trattato cinese di botanica del 1500 a.C. In India la canapa era ritenuta di origine divina, poiché si pensava provenisse dalla trasformazione dei peli della schiena di Visnù. In tutto il mondo islamico la canapa era tenuta in grandissima considerazione, poiché favoriva l’unione con la divinità.

I Cannabinoidi: (contenuto in THC) Marijuana (0,5 – 1,5%) Ganja (2 - 4%) Hashish (3 - 7%) (nero, afgano, pakistano…) Olio di hashish (20 - 40%) Sintetici: nabilone, dronabinolo, con potenza superiore ai naturali

Effetti del THC Effetti sedativi ed euforici Effetti allucinogeni (a dosi alte) Sensazione di benessere Rilassamento, calore Aumento dell’appetito Arrossamento tipico degli occhi Percezione alterata del tempo Sollievo dall’ansia Ansia e panico (timore di perdere il controllo) Incoordinazione motoria Difficoltà alla concentrazione Stato confusionale Nausea ….paranoia….compromissione delle capacità mnemoniche…SLATENTIZZAZIONE DI PSICOSI… …SINDROME AMOTIVAZIONALE (apatia, il soggetto appare inerte, perdita di interessi, abulia…)

Alcune caratteristiche del THC Distribuzione ai vari organi, soprattutto in quelli ad elevata concentrazione di adipe Eliminazione lenta: rimane nell’organismo per svariati giorni L’eliminazione lenta tende a prolungare ed intensificare gli effetti dei cannabinoidi successivamente fumati No sindrome astinenziale: tuttavia l’interruzione può determinare nervosismo, irrequitezza, diminuizione dell’appetito con perdita di peso, insonnia, aumento del sonno REM, tremore… Dipendenza psicologica soprattutto dovuta al piacere indotto dalla sostanza e al condizionamento del gruppo Forte tolleranza

L’alcol vietato in alcuni sport ma l’abuso dannoso per tutti Uso frequente In passato l’uso di liquori (es. brandy) come doping era una pratica diffusa Tradizionalmente uno degli sport dove è più frequente l’uso di alcol è il rugby

L’alcol vietato in alcuni sport ma l’abuso dannoso per tutti EFFETTI DOSE DIPENDENTI EFFETTI INDESIDERATI Depressione Attività riflesse già a piccole dosi Riduzione ansia e tensione nervosa Assunto a piccole dosi riduce l’ansia e la tensione nervosa Aumento della sicurezza di sé Alte dosi e ripetute Depressione dell’attività del sistema nervoso Alterazione della coordinazione Danni epatici

Consumatori di alcol in Italia (Fonte: Osservatorio permanente su giovani e alcol. Indagine Doxa 2001) Uso: 88% maschi, 73% femmine

Consumatori eccessivi di alcol in Italia (Fonte: Osservatorio permanente su giovani e alcol. Indagine Doxa 2001) % sul totale consumatori Eccedenza 9,6% maschi; 2,4% femmine; Abuso: 2,1% machi, 0,6% femmine

L’alcol vietato in alcuni sport ma l’abuso dannoso per tutti Impatto negativo sui tempi di reazione, sulla cordinazione occhio-mano e occhio-piede, sull’equilibrio, sulla contrazione muscolare per diminuita produzione di ATP (l'alcol etilico influenza il metabolismo epatico dei glucidi inibendo il processo di sintesi del glucosio, il suo deposito sotto forma di glicogeno e attivando il processo di demolizione del glicogeno, in questo modo tende a esaurire le scorte glucidiche e ostacola la loro reintegrazione) Squilibri ormonali (es. inibizione ipotalamica della produzione di GH) Eccessiva produzione di calore e disidratazione Reazioni avverse: effetti cardiovascolari e GI, deficit nutrizionali, patologie epatiche (cirrosi) e pancreatiche, osteoporosi (uso cronico), alterazioni SNC (atrofia cerebellare), dipendenza

Cervello normale Cervello alcolista

Farmaci che aumentano la performance Beta-2 agonisti Impiegati in clinica per il trattamento dell’asma Isoproterenolo, epinefrina, norepinefrina Salbutamolo, terbutalina, salmeterolo Amine simpaticomimetiche, proprietà anaboliche e facilitanti l’apporto d’ossigeno Ha suscitato perplessità l’elevato numero di atleti (soprattutto di endurance) che segnalano l’uso terapeutico di beta-2-agonisti (607 atleti alle Olimpiadi di Sydney 2000 Reazioni avverse: tachicardia, aritmie cardiache, cefalea, tremori, agitazione

Alcune localizzazioni dei recettori beta adrenergici ed effetti in seguito a stimolazione e inibizione Tessuto Recettore Stimolazione Inibizione Vasi sanguigni ß-1, ß-2 Dilatazione Contrazione Cuore ß-1 Effetto inotropo e cronotropo positivo Eff. inotropo e cronotropo negativo Muscolatura scheletrica Tremori ↑ massa muscolare e velocità di contr. muscolare Diminuzione tremori Bronchi ß-2 Inotropo= forza contrazione Cronotropo= frequenza contrazione

I motivi per cui i farmaci beta-agonisti sono considerati doping sono molteplici e tutti legati all’effetto che ricorda la stimolazione del sistema nervoso vegetativo simpatico: 1- aumento delle prestazioni cardiache 2- aumento del calibro bronchiale 3- aumento della vascolarizzazione del tessuto muscolare 4- effetti metabolici che favoriscono la produzione di substrati energetici muscolari 5- aumento della forza di contrazione muscolare

Un beta-2 agonista particolare Clenbuterolo (Clenasma®, Monores®, Spiropent®) Lunga durata d’azione. Rispetto agli altri β2 agonisti presenta una maggiore attività anabolizzante (forse per la diversa cinetica), inducendo i processi di sintesi delle proteine contrattili. .L’effetto diminuisce dopo 8-10 gg per la down-regulation dei recettori β2. Pertanto viene assunto con uno schema di tipo ciclico. Nei periodi di wash-out possono presentarsi sintomi di astinenza per la diminuzione degli effetti stimolanti il SNC. Le dosi come doping sono generalmente 4-5 volte superiori a quelle terapeutiche (20-40 mcg/die). Le reazioni avverse sono quelle tipiche dei β2 agonisti

Myocardial infarction in a 17-year-old body builder using clenbuterol                     Myocardial infarction in a 17-year-old body builder using clenbuterol. Kierzkowska B, Stanczyk J, Kasprzak JD. A case of non-Q myocardial infarction in a previously healthy 17-year-old body builder, who used clenbuterol, a long-acting beta(2) adrenergic agonist with anabolic and lipolytic effects, is reported. Only 1 case report of myocardial infarction associated with the use of clenbuterol was found in a literature review and that case was, however, associated with anabolic steroid use. This is the first case report to describe myocardial infarction in a young male body builder only taking clenbuterol. Circ J 2005; 69: 1144-6

Farmaci utilizzati in certe discipline Beta-bloccanti, soprattutto β-1 selettivi: atenololo, bisoprololo, metoprololo, nebivololo Azione bradicardizzante, anti-tremore, effetto ansiolitico Usati negli sport in cui è importante una buona coordinazione posturale: tiro con l'arco, tiro al piattello, bowling, bob, trampolino, tuffi, nuoto sincronizzato, pentathlon, ecc. Effetti negativi sulla resistenza fisica

Usi clinici dei  BLOCCANTI Ipertensione Angina pectoris Infarto del miocardio Aritmie Scompenso cardiaco Profilassi dell’emicrania

Reazioni avverse dei  BLOCCANTI Broncospasmo (controindicati negli asmatici) Ipoglicemia Crampi Aritmie, insufficienza cardiaca Insonnia, incubi Depressione, diminuzione libido Disturbi gastro-intestinali Cefalea, vertigini, diplopia

Altri farmaci (non vietati) anti-tremore: gli ansiolitici Barbiturici Benzodiazepine (BDZ) I barbiturici nella pratica clinica sono stati sostituiti , per la loro minore tossicità, dalla benzodiazepine (Valium®, Halcion®, En®, Xanax®, ecc. ecc.) E’ difficile stimare il ricorso agli ansiolitici da parte di atleti Gli effetti farmacologici delle BDZ sono: Ansiolitico Ipnotico Anticonvulsivante Miorilassante

Complesso recettoriale del GABA GABA site Barbiturate site Benzodiazepine site Steroid site Picrotoxin site From Olsen and Sapp, 1995

BENZODIAZEPINE potenziamento GABA inibizione NA DA Ach 5-HT GLICINA Possibile meccanismo d’azione delle benzodiazepine. NA = noradrenalina; DA = dopamina; Ach = acetilcolina; 5-HT = serotonina

BENZODIAZEPINE: reazioni avverse Comuni Meno comuni Rare Eccessiva sedazione Effetti residui dopo l’assunzione serale (hangover) Diminuzione della performance psicomotoria e cognitiva Stanchezza muscolare Disturbi della memoria (amnesia anterograda) Confusione mentale (soprattutto negli anziani) Atassia, vertigini Effetti paradossi (stati di irrequietezza, irritabilità depressione Reazioni cutanee Il problema più serio è la possibilità d’insorgenza della dipendenza

Diuretici e Agenti Mascheranti

Perdere peso o mascherare Diuretici Rapida perdita di peso Particolarmente utilizzata nel wrestling, boxe, judo e negli altri sport che prevedono categorie di peso Aumentano l’escrezione e la diluizione di sostanze illecite Usati, come detto, per ridurre la ritenzione di fluidi da uso di AAS L’impatto sulla performance è complessivamente negativo Provocano disidratazione, ipotensione, crampi muscolari, squilibri elettrolitici

Diuretici proibiti nello sport (lista WADA 2006) Classe di Farmaci Nome Inibitori anidrasi carbonica Acetazolamide Diuretici dell’ansa Furosemide Indapamide Bumetamide Acido etacrinico Tiazidici e simili Bendroflumetiazide Clorotiazide Idrochlorotiazide Clortalidone Metolazone Risparmiatori di potassio Amiloride Triamterene Spironolattone Canrenone Agenti uricosurici Probenecid

Altre sostanze “mascheranti” proibite (WADA 2007) Probenecid Epitestosterone Inibitori alfa-reduttasi (es. finasteride) Plasma expander (es. albumina, destrano)

Il futuro del doping: i geni? Doping genetico I progressi nell’ambito della genetica con la definizione del genoma umano (circa 30.000 differenti geni) aprono prospettive molto interessanti per il trattamento di diverse patologie Il timore è che la manipolazione genetica venga applicata anche per cercare di migliorare la performance sportiva Segnali in questo senso sono già emersi. E’ già stato inserito nella lista WADA dei metodi proibiti Non bisogna credere che la manipolazione genetica delle cellule somatiche sia una pratica esente da rischi

GENE FUNZIONE DNA RNA Proteina Trascrizione Traduzione Per Terapia Genica si intende il trasferimento di materiale genetico (DNA o RNA) alle cellule somatiche umane allo scopo di prevenire o trattare patologie. Il Doping genetico usa le stesse tecniche della Terapia Genica allo scopo di migliorare la prestazione sportiva.

Ingegneria genetica / tecniche di manipolazione Segmenti specifici di DNA possono essere tagliati e isolati I segmenti isolati si possono ricombinare con un vettore plasmidico Il plasmide è trasferito in un batterio dove viene moltiplicato Il DNA ricombinato può essere ricombinato ulteriormente per ottenere la molecola finale desiderata La molecola finale è trasferita nelle cellule o nell’organismo

Tre diverse modalità di trasferire materiale genetico In vitro EX-VIVO Le cellule target vengono isolate dal soggetto, coltivate, modificate geneticamente in vitro e quindi reimpiantate nello stesso soggetto - muscolo - cervello - articolazioni - ecc. IN-VIVO topico Introdurre dei vettori contenenti materiale genetico in una specifica localizzata sede del corpo - endovena - intra-arteriosa - inalatoria, ecc. IN-VIVO sistemico Introdurre dei vettori contenenti materiale genetico nel sangue

Trasferimento non-virale Due tipi di vettori per il trasferimento di materiale genetico a b Trasferimento non-virale (transfettazione) DNA nudo, liposomomi, oligonucleotidi Trasferimento virale (infezione) Adenovirus, retrovirus, ecc.

I tre possibili livelli del doping genetico Prima della competizione (effetti anabolizzanti) Manipolazione genetica Durante la competizione (sostanze che migliorano la performance) Dopo la competizione (sostanze di riparo)

Quali approcci di ingegneria genetica si possono ipotizzare come doping? ex vivo, tessuto emopoietico: modificare l’emopoiesi (recettore EPO, trasporto O2...) in vivo locale (es. muscolo): fattori di crescita, modificatori fibre muscolari cardio-modulatori, ecc. in vivo locale (es. articolazioni): sostanze antidolorifiche, inibitori dell’infiammazione, fattori di riparo, ecc. in vivo sistemico: anabolizzanti, fattori ormonali, killer del dolore, controllo vascolare, ecc.

Esempi di approcci al doping genetico Ormone della crescita umano (hGH) Transfettazione in vivo: geni che producono hGH posti in uno speciale involucro proteico Utilizzati come spray da inalare nel sistema bronchiale Iniettati direttamente nel sangue Incrementata produzione di hGH

Approcci al doping genetico Geni producenti hGH posti in mioblasti da iniettare nel muscolo scheletrico. Le cellule vengono integrate dalla struttura muscolare e cominciano a produrre hGH Sono stati effettuati esperimenti su animali iniettando tali cellule nel muscolo, dopo 3 mesi i livelli di hGH nel sangue erano 8 volte superiori Con una metodica simile sono stati trattati (trial sperimentali) pazienti con la distrofia di Duchenne. Il gene mancante della distrofina è stato posto in mioblasti poi iniettati nel muscolo dei pazienti

Approcci al doping genetico Eritropoietina Inserire il gene dell’eritropoietina in cellule da impiantare o iniettare sottocute o inalare e che poi producono EPO. Esperimenti su animali (topi e scimmie) con inserimento del gene per l’EPO hanno portato ad aumenti del 80% dell’ematocrito (Gene Ther 1998; 5:665) Potremmo diventare tutti come Eero Mäntyranta!!

Approcci al doping genetico Fattori di crescita endoteliali vascolari(VEGF) Geni che codificano per VEGF possono promuovere la crescita di nuovi vasi sanguigni consentendo un maggiore apporto di ossigeno ai tessuti. Finora sono stati fatti esperimenti come terapia genica per malattie quali ischemia cardiaca o insufficienza arteriosa periferica (Circulation 2002; 105:2012; Circulation 2003; 108:1933)

Approcci al doping genetico Gene della miostatina La miostatina è una proteina regolatrice della crescita muscolare. Appartiene alla superfamiglia dei TGF-beta E’ responsabile del differenziamento dei muscoli scheletrici Ha una funzione inibitoria della proliferazione delle cellule satelliti alle fibre muscolari. Mutazioni genetiche (es. ceppo bovino Belgium blue bull) provocano abnormi crescite dei muscoli Due strade: modificare il gene che codifica la miostatina o somministrare inibitori della miostatina (es. follistatina) Vedi: Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:9306

Esperimenti su topi Topi privati del gene della miostatina (topi knock out) sviluppano una muscolatura ipertrofica:

Gli inibitori della miostatina sono già in vendita!!!

L’esercizio inibisce i livelli di miostatina: esperimenti sul ratto A. Matsaka et al. Acta Physiol Scand 2005; 183: 299-307

Approcci al doping genetico Insulin like Growth Factor 1 (IGF-1) Dopo iniezione intramuscolare, in animali, di un plasmide contenente il gene umano per IGF-1 quest’ultimo veniva espresso nei muscoli (Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:15603) Risultato: incremento della forza muscolare La NASA sta conducendo esperimenti genetici per prevenire l’atrofia muscolare indotta dai viaggi spaziali (BJ Med Sports 2006; 40:4) Reazione a catena polimerasi Effetti avversi?? (questi fattori di crescita regolano anche la crescita di tumori ormono-dipendenti) L’incremento di IGF-1 non riscontrabile nel sangue o nelle urine. Si dovrebbe effettuare una biopsia muscolare per individuare la manipolazione genetica con la PCR

Fibra muscolare Nuclei Cellula satellite Sezione della fibra Nel muscolo normale i nuclei multipli delle fibre sono responsabili della produzione di nuove proteine. Quando è necessario un processo di riparo segnali chimici (IGF-1) stimolano le cellule satelliti a proliferare e a fondersi con le fibre in modo da contribuire con i loro nuclei al riparo delle fibre. La presenza di un numero maggiore di nuclei e quindi di nuove miofibrille consente di riparare il danno muscolare.

Iniezione di un gene nella fibra muscolare Vettore Fibra muscolare Gene sintetico Nucleo Recettore miostatina Bloccante miostatina Miostatina Incremento della fibra fino al 40% Un gene sintetico, all’interno un vettore, può essere posto in un muscolo. Il vettore trasporterà il gene in un nucleo da dove dirigerà la produzione di una proteina. Se il gene produce IGF-I o una proteina che blocca la miostatina questo porterà a maggiore proliferazione delle cellule satelliti e quindi all’irrobustimento della fibra muscolare.

Nuovi approcci al doping genetico Nel 2000 sono stati identificati due nuovi fattori di crescita, espressi dal muscolo, derivati dal gene del IGF-1 per splicing alternativo Muscle L. IGF-1 simile all’IGF-1 epatico Mechano Growth Factor (MGF) individuabile solo quando il muscolo è in esercizio o stirato Reazione a catena polimerasi MGF sembra avere solo azione locale infatti non si ritrova nel sangue MGF sembra proteggere il muscolo cardiaco e i muscoli scheletrici, inducendo processi riparativi locali e prevenendo l’apoptosi

Nuovi approcci al doping genetico Vi sono anche evidenze che il MGF sia coinvolto nel mantenimento del tessuto nervoso, poiché è noto che IGF-1 è trasportato dentro i neuroni Se MGF viene posto in un gene manipolato e immesso nei muscoli di un topo di laboratorio: in 2 settimane si ha un incremento del 20% della massa muscolare Reazione a catena polimerasi Quando, con un simile approccio, si immette nel muscolo IGF-1 epatico si ottiene lo stesso incremento del 20% della massa muscolare ma soltanto dopo 4 mesi

Rischi ipotizzabili con il doping genetico A lungo termine Fibrosi Tumori Effetti avversi tipici dei fattori stimolati Impossibilità di terapia genica futura (immunità) A breve-medio termine Autoimmunità Sindrome simil- influenzale Shock tossico Legati alle modalità di trattamento Malpratica (vettore o via somministrazione inadeguati) Materiale contaminato (patogeni o allergeni) Mancanza di follow-up

Record legati alle differenze genetiche tra le popolazioni? Gli studi ci dicono che le differenze genetiche sono maggiori tra gli individui che non tra le popolazioni Lancet 2005; 366 (suppl 1): S16

Gli studi genetici per selezionare gli atleti I progressi nel campo della genetica aprono la prospettiva di individuare quale corredo genetico è più o meno favorevole per la riuscita in un determinato sport. Effettuando uno screening genetico sui bambini si potranno individuare quelli da indirizzare ad una certa attività sportiva, quelli da indirizzare ad un’altra attività sportiva, quelli da “scartare”. Lo screening genetico potrebbe essere attuato anche ad atleti adulti per selezionare individualizzati e specifici metodi di allenamento. Per fortuna non siamo determinati solo dalla sequenza delle basi del nostro DNA………….. Vedi per approfondimento: Rankinen T. et al. Med Sci Sports Exerc 2001; 33:855; Med Sci Sports Exerc 2002; 34:1219

Ricordiamoci che il genoma non è l’unico fattore……. geni abitudini ambiente Distrofia muscolare Tumore al seno familiare Tumore polmonare Tumore al seno Anche condizioni acquisite: traumi fratture ustioni infezioni possono essere più frequenti In certi soggetti per fattori genetici Obesità Aterosclerosi Alzheimer Parkinson