DNA Replication

DNA Replication II

Replicazione e ricombinazione del DNA La replicazione semiconservativa Tre modelli proposti per la replicazione del DNA La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA

Esperimento di Meselson e Stahl - centrifugazione in gradiente di densità all’equilibrio per distinguere DNA contenenete 14N pesante e DNA 15N più leggero

DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA: Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.

Le modalità di replicazione 1. La replicazione teta Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare

2. La replicazione a circolo rotante Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli

3. La replicazione lineare negli eucarioti Requisiti per la replicazione: -stampo di DNA a singolo filamento -substrati da assemblare nel filamento di neoformazione -enzimi e altre proteine che “leggono” lo stampo e assemblano i substrati

La direzione della replicazione

La sintesi del DNA è continua su un filamento di DNA stampo e discontinua sull’altro

Modello teta Modello circolo rotante Replicazione lineare

La replicazione del DNA batterico - L’INIZIO In E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oriC, l’origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.

- LO SVOLGIMENTO La DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5’ 3’ lungo il filamento.

GLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTO La primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3’-OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.

The "real" polymerase in E. coli DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli At least 10 different subunits "Core" enzyme has three subunits - , , and  Alpha subunit is polymerase Epsilon subunit is 3'-exonuclease Theta function is unknown The beta subunit dimer forms a ring around DNA Enormous processivity - 5 million bases!

DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3' Nucleotides are added at the 3'-end of the strand Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before the new strand dissociates from template 20 cycles constitutes moderate "processivity" Pol I from E. coli is 928 aa (109 kD) monomer In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5' exonuclease and 5'-3' exonuclease activities

- La DNA LIGASI La DNA ligasi chiude l’interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest’ultima ha aggiunto il nucleotide finale.

- LA FORCELLA DI REPLICAZIONE Modello di replicazione del DNA in E.coli: le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.

LA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA -selezione dei nucleotidi -correzione di bozze -riparazione dei malappaiamenti

Other Proteins That Assist DNA Replication Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein Table 16.1

La replicazione del DNA negli eucarioti Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi

Polimerasi nei Procarioti I Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi: DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore

Polimerasi negli Eucarioti Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da: DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi. DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki. DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.

Prokaryotes Eukaryotes 5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--a,b,g,d,e I--excision repair, removal of RNA primers  a--polymerization II-repair b--repair g--mitochondrial III-main enzyme d-main enzyme IV,V-repair, special conditions e--unknown polymerases also exonucleases not all exonucleases 1 Origin of replication many origins Okazaki fragments 1000-2000 nuc. Okazaki fragments 150-200 nuc. no proteins on DNA histones

Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3') Vertebrati Homo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis TTAGGG Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8) Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia protozoi ciliati Tetrahymena, Glaucoma TTGGGG Paramecium TTGGG(T/G) Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTTTGGGG Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C) Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGG Alghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGG Insetti Bombyx mori TTAGG Anellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8) Lieviti gemmanti Saccharomyces cerevisiae TGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA) o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso) Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT Candida tropicalis GGTGTA[C/A]GGATGTCACGATCATT Candida maltosa GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT Candida guillermondii GGTGTAC Candida pseudotropicalis GGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT Kluyveromyces lactis GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Modello di Holliday:rottura singolo filamento

Rottura doppio filamento