Le Cicline Luca Orlando Corso di biochimica prof. Tiziana Crepaldi UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TORINO SCUOLA UNIVERSITARIA INTERFACOLTA’ PER LE BIOTECNOLOGIE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI Le Cicline Luca Orlando Corso di biochimica prof. Tiziana Crepaldi

Le Cicline D E A B Cicline Mitotiche (M) B1/B2 Cdk1 Cicline G1 D1/D2/D3 Cdk4/6 1)Le cicline, assieme alle CdK (chinasi dipendenti da cicline), sono il cuore del controllo del ciclo cellulare. La diversa combinazione nella formazione dei complessi ciclina-CdK porta all’entrata o uscita dalle varie fasi del ciclo cellulare tramite la fosforilazione di proteine target. Le cicline mitotiche (B1 e B2) agiscono nella fase M del ciclo cellulare complessando con CdK1. Le cicline G1 sono chiamate cicline D (1,2,3) e agiscono nelle fasi precoci G1 complessando in varie combinazioni con CdK4 e 6; Le cicline G1/S, ovvero le cicline E (E1 ed E2) invece agiscono più tardivamente nella fase G1 complessando con Cdk2 svolgendo funzioni sino alla fase S. Le cicline S sono le cicline A, (A1 e A2) e svolgono le funzioni più importanti nella fase S, ma sono attive anche nella fase tardiva di G1 e precoce di M, legandosi prima con CdK2 e successivamente con CdK1. Non è ben chiaro come facciano a svolgere specifici ruoli in tutte queste fasi. E’ noto però che A1 è espressa solo nelle linee germinali, che il KO per A2 porta a letalità embrionale e che il complesso A2-CdK2 inizia la sua azione nella fase tardiva di G1 andando a fosforilare substrati importanti per la replicazione del DNA e poi andando a stimolare in G2 CdK mitotiche. E’ importante sottolinare che se un tipo di ciclina agisce solo in una determinata fase non vuol dire che non sia presente anche in altre. (ad esempio le cicline M si accumulano per tutta la fase S per poi agire principalmente nella fase M), Nelle altre fasi però non hanno la concentrazione necessaria oppure viene impedita la loro azione con meccanismi di inibizione della formazione di un complesso attivo. E1/E2 Cdk2 Cicline G1/S Cicline S A1/A2 Cdk2/1 Altre cicline F, G, H

Cicline Mitotiche  Mitosi scatenata da complesso B-Cdk1 attivato dopo completamento della fase S  L’attivazione B-Cdk comincia con l’accumulo della ciclina mitotica durante fase G2 2)Gli eventi che scatenano la mitosi sono indotti dal complesso ciclina M-CdK1, che sono attivati al completamento della fase S. L’attivazione M-CdK comincia con l’accumulo della ciclina mitotica, ma il complesso deve essere poi attivato da una serie di fosforilazioni e defosforilazioni attivatorie da parte di kinasi e fosfatasi specifiche Alberts, 4th edition

 Il complesso B-Cdk1 attivato media tutti gli eventi cellulari necessari per la mitosi (condensamento cromosomi, assemblamento fuso mitotico,riarrangiamento citoscheletro di actina/microtubuli, dissassemblamento della lamina nucleare…)  Uno dei ruoli più importanti è mediare l’attivazione di APC (anafase promoting complex)La sua attività proteolitica permette lo svolgimento dell’anafase e la proteolisi della ciclina B, terminando la mitosi. 3) Il complesso ciclina mitotica-chinasi media quasi tutti gli eventi necessari per la mitosi (condensamento cromosomi, assemblamento fuso mitotico, riarrangiamento del citoscheletro di actina/microtubuli, dissassemblamento della lamina nucleare…) fosforilando proteine target. Uno dei ruoli più importanti è mediare l’attivazione dell’anafase promoting complex. Questo complesso, quando lega Cdc20 ed è attivato, ha attività proteolitica verso la proteina Securina, che tiene inattiva la proteina Separasi. Quest’ultima, quando liberata, degrada il complesso della coesina, che tiene uniti i cromatidi fratelli, permettendo la loro separazione e lo svolgimento dell’anafase. Lo stesso APC attivato è capace di degradare la ciclina B: si forma così un feedback negativo che porta al termine dell’attivazione del complesso M-CdK e alla fine della mitosi. Alberts, 4th edition

Negli embrioni precoci l’inattivazione di B-CdK1 è data interamente dall’azione di Cdc20-APC Alberts, 4th edition Cellule però con fase G1 hanno bisogno di meccanismo protettivo da riattivazione di CdK 4) Negli embrioni precoci, il ciclo cellulare è un rapido susseguirsi di fasi M ed S, in quanto deve esserci una rapida proliferazione cellulare che non necessita di un tempo di stasi G1 per permettere alla cellula di crescere di dimensioni e monitorare l’ambiente. La sintesi di ciclina M è quindi costante attraverso il ciclo cellulare, ed è sufficiente il solo complesso Cdc20-APC attivato per creare l’oscillazione tra fase M ed S. Infatti un’alta concentrazione di ciclina M attiva APC, che una volta attivato distrugge la ciclina stessa. Basse concentrazioni di ciclina disattivano APC e così la concentrazione di M può di nuovo gradualmente aumentare per tutta la fase S fino ad arrivare di nuovo ad un livello tale da attivare nuovamente APC e la mitosi, e così via. Cellule che hanno però necessità di una fase G1 devono impedire la riattivazione di Cdk che avverrebbe subito dopo il termine della mitosi, e quindi il complesso APC- CdC20 non è più sufficiente: interviene infatti un analogo di Cdc20 chiamato Htc1. Interviene molecola simile a cdc20 attivante APC: Htc1

inibito da B-Cdk1 (fosforilazione diretta di Hct1) Cdc20-APC attivato da B-Cdk1 Htc1-APC inibito da B-Cdk1 (fosforilazione diretta di Hct1) Alberts, 4th edition Quindi l’attività di Htc1-APC inizia quando cdc20-APC comincia la distruzione della ciclina B 5) Sia Htc1 che Cdc20 legano ed attivano APC, ma differiscono di un aspetto importante: Cdc20-APC è attivato da M-CdK mentre Htc1-APC è inibito da M-CdK tramite fosforilazione diretta su Htc1. Quindi, quando la ciclina M è a basso livello si attiva Htc1 che impedisce che la sua concentrazione possa risalire per tutta la fase G1. Sono poi le cicline G1 che spengono Htc1 per permettere che nella fase S la ciclina M ricominci ad aumentare. Htc1-APC ha un' azione quindi complementare a Cdc20-APC: la sua azione comincia proprio quando l’altro complesso sta diminuendo (figura B). Alberts, 4th edition

cicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggior ko delle cicline B cicline B1 e B2 sono entrambe coespresse nella maggior parte delle cellule dividenti diversa localizzazione subcellulare B1 citoplasmatica, associata a microtubuli B2 associata alla membrana interna Hanno inoltre diverso pattern di espressione durante spermatogenesi murina 6)Le cicline B1 e B2 sono le cicline mitotiche, e si complessano con CdK1. Sono entrambe coespresse nella maggior parte delle cellule dividenti anche se differiscono nella loro localizzazione subcellulare. B1 è associata a microtubuli, e nel late G2 entra anche nel nucleo. B2 è invece associata alla membrana citoplasmatica interna. E’ possibile quindi che abbiano ruoli specializzati diversi, come si sa avvenga ad esempio nella spermatogenesi in topo. ruoli specializzati diversi

vengono generati ceppi omozigoti per il gene ciclina B deleto della Ciclin Box, sito di contatto con Cdk1 Brandeis et al., 1998 B2-/- Vitali, leggermente più piccoli, fertili , nessun tessuto anormale. B1-/- Letalità embrionale. B1 gene fondamentale 7)Per osservare l’effetto della privazione delle cicline mitotiche vengono generate delle linee di topo i cui geni delle cicline B sono privi della ciclin Box, attraverso un costrutto in cui la cassetta di resistenza Neo sostituisce gli esoni 5 e 6, corrispondenti appunto a questo dominio. La ciclin box permette il contatto della ciclina con la chinasi, e quindi anche se espressa non può più contattare e attivare la chinasi. KO di B2 non porta ad un fenotipo letale: I topi sono vitali, non hanno nessuna anomalia tissutale e sono fertili. Sono solo leggermente più piccoli. KO per B1 porta invece a letalità embrionale precoce: B1 è quindi un gene fondamentale. La spiegazione di questa variazione di fenotipo, nonostante entrambe le cicline siano espresse in tutti I tessuti aventi cellule proliferanti è che probabilmente B1 riesce a sopperire la mancanza di B2 portando CdK1 sui substrati di B2, mentre non avverrebbe il contrario proprio per l’associazione di B2 alla membrana e quindi scarsa mobilità nella cellula. B1 probabilmente riesce a sopperire alla mancanza di B2 portando Cdk1 sui substrati di B2. B2 essendo associato alla membrana non riuscirebbe a sopperire alla mancanza di B1

Cicline G1  Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando Sherr., 2004  Cicline D (1/2/3) agiscono precocemente complessando con Cdk4/6 sotto stimolo di mitogeni 8) La figura 1 mostra come il sistema di azione delle cicline sia conservato dal lievito fino agli organismi superiori. Le cicline D si dividono in D1, D2 e D3. Agiscono precocemente complessando con CdK4 e CdK6 sotto stimolo di mitogeni. I mitogeni attivano la via Ras-MAP chinasi che porta alla promozione trascrizionale di geni delle cicline D ed altri fattori per la stabilità e migrazione nel nucleo del complesso. L’incremento di ciclina D e il conseguente incremento di complesso D-CdK porta a due principali effetti: 1) il complesso fosforila Rb, che a questo punto si stacca dal fattore trascrizionale E2F che può quindi attivare la trascrizione di geni delle cicline E, A ed altri implicati nella fase S (es per la trascrizione del DNA). 2) Sequestra p27, inibitore di CdK2 impedendogli di migrare nel nucleo. Solitamente, al termine della loro funzione, le cicline D vengono degradate per poi essere risentitizzate nei cicli successivi. In cellule che invece necessitano di una rapida uscita da G0 (es: linfociti T) esse sono già presenti e persistono per essere già pronte per il ciclo successivo.  La sua azione opera su gli inibitori Rb e p27  Persiste o viene risintetizzata in base al tipo cellulare

Cicline G1 Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27 (Sherr., 2004) Attivazione E-Cdk2 amplifica effetto su Rb e p27 ma in modo diverso: passaggio a indipendenza da mitogeni 9) l’effetto delle cicline D attiva quindi E-CdK2, che è più tardivo e massimo nella transizione da G1 a fase S. Questo complesso agisce anch’esso su Rb e p27, amplificando l’effetto delle cicline D, ma in modo diverso: se l’azione delle prime era transitoria, l’azione di E-Cdk2 porta ad una rimozione molto più duratura degli inbitori, ovvero una fosforilazione più difficile da rimuovere su Rb e la degradazione di p27: si passa così ad uno stato mitogeno-indipendente. Gli altri substrati sono poi coinvolti direttamente nel ciclo cellulare (istoni, centrosomi, origine di replicazione...). La ciclina E termina il suo effetto poi nella fase S tramite fosforilazione della stessa CdK2 o di GSK-3beta. CdK2 invece regola la progressione del ciclo cellulare attraverso le sue interazioni sia con la ciclina E che con A2, estendendo la sua funzione oltre la regolazione di G1 e governando eventi in S e G2/M. I substrati sono coinvolti direttamente nel ciclo cellulare (istoni, centrosomi, origine di replicazione...) La ciclina E viene poi degradata per P diretta da Cdk2 GSK-3B. Cdk2 lega poi con ciclina A estendendo ruolo sino a fase G2

D1-/- : Vitale, più piccolo, anomalie alla retina/mammella ko delle cicline D D1-/- : Vitale, più piccolo, anomalie alla retina/mammella D2-/-: Vitale, femmine non fertili, difetti celebrali e in LB D3-/-: Vitale. no maturazione LT nel Timo tessuto colpito specifico per quella ciclina: Ridondanza Doppio Ko: combinazione dei Ko singoli Es:D2/3-/- (solo D1): Morte prenatale per anemia megaloblastica (no linfociti maturi) C’è però sviluppo e organogenesi 10) Il singolo KO delle diverse cicline D porta ad un fenotipo vitale con embriogenesi normale, solamente con un corpo più piccolo. A livello tissutale si osservano anomalie solo dove è espresso specificatamente un solo tipo di ciclina D: se manca la ciclina D1 ci sono difetti nella retina e nella mammella, se manca D2 difetti di fertilità, al cervello e linfociti B, se manca D3 c’è mancata maturazione dei LT. Ciò suggerisce che negli altri tessuti vi sia alta ridondanza dell’azione tra queste cicline. IL KO di due cicline D contemporaneamente porta ad un fenotipo che è la combinazione dei KO singoli (es se manca D2/D3 si ha morte prenatale per anemia megaloblastica in quanto mancano linfociti T maturi). Gli animali con una sola ciclina perdono a livello embrionale la specificità di questa, up regolando il gene rimanente anche nei tessuti dove questo non è solamente espresso. Più avanti nella crescita questo non riesce più ad avvenire e c’è morte prima della nascita. Il fatto però che vi sia sviluppo ed organogenesi sino alla nascita porta a chiedersi se sia sufficiente una sola ciclina o se lo sviluppo sia indipendente dalle cicline D. Basta una sola ciclina? Proliferazione indipendente da ciclina D?

Triplo KO: morte intrauterina ma dopo organogenesi Proliferazione indipendente da D Livello di E, A Cdk2 non modificato (compensazione Cdk2 /altri meccanismi) MEFs incapaci di uscire da Go D fondamentale per sviluppo SC (Kozar et al., 2004) KO Cdk4/6 Singolo: Vitale Doppio: Simile effetto KO cicline D 11) Per rispondere a questo quesito viene generato il triplo KO per le cicline D. Questi topi muoiono già nell’utero, ma dopo l’organogenesi: la proliferazione e sviluppo è quindi indipendente dalle cicline D. Lo studio inoltre dell’espressione di altre proteine a valle delle cicline D, quali ad esempio altre cicline come E, A o chinasi come Cdk2 mostrano che il livello di queste non è modificato, suggerendo che vi siano meccanismi di compensazione o non ancora conosciuti per ovviare alla mancanza delle cicline D. Sempre dal triplo KO si è potuto osservare come MEFs (mouse embrionic fibroblasts) prelevati da questi topi fossero incapaci di uscire dallo stato di quiescenza GO, e quindi come in questo ruolo le cicline D siano invece fondamentali, tanto che nemmeno le stem cells sono più in grado di riattivarsi e differenziarsi. Risultati simili sono stati osservati tramite il KO delle chinasi associate a cicline D CdK4 e 6, osservando inoltre come in vitro, in mancanza di queste due chinasi, CdK2 possa legarsi con D, suggerendo un possibile meccanismo di compensazione. Cdk2 capace di legare D in vitro: complementazione?

Vitali (fino a 2 anni!), sterili. KO Cdk2 Vitali (fino a 2 anni!), sterili. MEFs proliferano bene dificoltà passaggio G0/ G1 KO Cicline E Singolo E1/E2: Vitale. Doppio: Aborto per malformazione trofoblasti Embrioni tetraploidi: morte prenatale per anomalie cardiache MEFs incapaci di uscire da G0 12) CdK2, per i suoi ruoli in varie fasi del ciclo e la sua capacità di legarsi con diverse cicline, si supporrebbe sia una proteina fondamentale. Il suo KO invece mostra un fenotipo vitale e senza nessuna anomalia, tranne che per una difficoltà di passaggio dalla fase GO a G1 dei suoi MEFs. IL KO delle cicline E invece mostra come esse possano essere efficientemente ridondanti in quanto il KO singolo di ognuna di loro mostra un fenotipo vitale , mentre il doppio KO porta ad una morte prenatale precoce e MEFs incapaci di uscire da GO, mostrando la loro essenzialità per sviluppo e vitalità dell’organismo. IL fatto che le cicline E siano essenziali e il loro KO porti ad un fenotipo molto più grave che il KO di CdK2, suggerisce che le cicline E abbiano dei ruoli indipendenti da CdK2 o che agiscano in complesso con un altri partner sconosciuti. Gene essenziale:Fenotipo più grave che mancanza di Cdk2: ciclina E indipendente da Cdk2 o altro partner sconosciuto.

CONCLUSIONI Negli eucarioti la presenza di Cdk molteplici permette aumento di combinazioni (più specificità) ma anche possibilità di interscambio  La perdita di complessi G1- Cdk è complementato da isoforme o da altre cicline conosciute/sconosciute IL fatto che vengano attivati effettori a valle anche con ko indica la presenza di meccanismi alternativi 13) In conclusione negli eucarioti la presenza di CdK molteplici permette un aumento di combinazioni con le diverse cicline dando maggiore specificità ma anche possibilità di interscambio, permettendo così che nessun complesso ciclina CdK sia essenziale. La perdita dei complessi G1-CdK è compensato da isoforme o da altre cicline conosciute o non ancora scoperte. Il fatto che vengano attivati effettori a valle anche quando complessi più precoci siano KO indica la possibilità di meccanismi di attivazione alternativi non ancora conosciuti. La ciclina E è una proteina essenziale, mentre CdK2 e il complesso D-CdK non sono essenziali per il ciclo cellulare somatico. Tutti i complessi G1-CdK sono però essenziali per l’uscita dallo stato di quiescenza (GO) Complesso D-Cdk e Cdk2 non sono essenziali per il ciclo cellulare cellule somatiche. Sono però fondamentali assieme ad E per l’uscita dalla quiescenza (G0)

IMPLICAZIONI NEL CANCRO Cicline D/E fondamentali per uscita quiescenza di SC Importanza in Cancer Stem Cells? (Kozar et al., 2004) MEFs mancanti di cicline G1 o relative Cdk resistenti all’azione di oncogeni come Ras, Myc p53DN IN VIVO: Cdk4-/- : refrattari a tumori alla pelle mediato da Ras, mentre i cheratinociti proliferano normalmente D1-/- : protezione da tumore alla mammella e intestinale 14) Siccome le cicline G1 sono essenziali per l’uscita dalla quiescenza delle stem cells, ci si chiede se possano avere dei ruoli per l’uscita dalla quiescenza delle cancer stem cells. MEFs privi di cicline G1 o delle relative CdK sono resistenti all’azione di oncogeni quali Ras, Myc o p53 dominant negative. In studi in vivo inoltre, topi KO per CdK4 mostrano refrattarietà all’ insorgenza di tumori alla pelle indotti da Ras mentre KO per D1 mostrano protezione da tumori alla mammella e all’intestino.

Cicline G1 possibile target antitumorale? PRO  Mancanza di G1- Cdk attivato non sembra coinvolgere la funzionalità e proliferzione delle cellule somatiche  Un solo target conferisce resistenza CONTRO  Implicazione delle cicline non ancora chiarita  Effetto solo con alcuni oncogeni (es Ras)  G1- Cdk fondamentale per differenziazione stem cells. 15) i complessi G1-CdK potrebbero quindi essere considerati come possibili target antitumorali, in quanto la mancanza di questi complessi non sembra coinvolgere la funzionalità e la proliferazione delle cellule somatiche. Inoltre si conferirebbe resistenza dai tumori andando a colpire un solo target, vantaggio di sicura importanza in terapie antitumorali. Di contro però bisogna sottolineare che l’implicazione delle cicline nell’uscita della quiescenza e resistenza a tumori non è del tutto chiarita, che la resistenza avviene solo con specifici oncogeni (es Ras) e che soprattutto il complesso G1-CdK è fondamentale per la differenziazione delle Stem cells sane e quindi la sua mancanza può portare ad effetti collaterali notevoli.

BIBLIOGRAFIA Living with or without cyclinsand cyclin-dependent kinases Charles J. Sherr1, and James M. Roberts GENES & DEVELOPMENT 18:2699–2711 Development of mice expressing a single D-type cyclin Maria A. Ciemerych, Anna M. Kenney, Ewa Sicinska, Ilona Kalaszczynska, Roderick T. Bronson, David H. Rowitch, Humphrey Gardner, and Piotr icinski1 GENES& DEVELOPMENT 16:3277–3289 Anticancer drug targets: cell cycle and checkpoint control Geoffrey I. Shapiro and J. Wade Harper Journal of Clinical Investigation December 1999 | Volume 104 | Number 12 1645 Cyclin B2-null mice develop normally and are fertile whereascyclin B1-null mice die in utero MICHAEL BRANDEIS, IAN ROSEWELL, MARK CARRINGTON, TESSA CROMPTON, MARY ANN JACOBS, JANE KIRK,JULIAN GANNO, AND TIM HUNT Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 4344–4349, April 1998 Mouse Development and Cell Proliferation in the Absence of D-Cyclins Katarzyna Kozar Maria A. Ciemerych,Vivienne I. Rebel Hirokazu Shigematsu, Agnieszka Zagozdzon, Ewa Sicinska,Yan Geng, Qunyan Yu, Shoumo Bhattacharya, Roderick T. Bronson, Koichi Akashi, Cell, Vol. 118, 477–491, August 20, 2004,