Enzimi: concetti di base e meccanismi di catalisi enzimatica a. Classificazione, meccanismo d’azione b. Esempi di reazioni catalizzate c. Descrizione di alcune tipiche proteine enzimatiche. Cofattori e vitamine a. caratteri generali, funzioni, effetti biologici b. regolazioni metaboliche delle vitamine A, D, E, F, K, B1, B2, B3, B6, B8, B12, C, H, PP; c. trasformazione di vitamine in coenzimi.

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry Gli enzimi Gli enzimi promuovono effetti catalitici. Possono essere proteine semplici ma spesso possiedono un gruppo prostetico che è fondamentale per la regolazione degli effetti catalitici. Quando siamo in presenza di un enzima che sia una proteina coniugata si indica:   Oloenzima= apoenzima+coenzima Apoenzima: parte proteica semplice, alcuni enzimi sono solo apoenzimi Coenzima: gruppo prostetico, parte non proteica (derivato da una vitamina o metallo) che determina gli effetti catalitici Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Classificazione degli enzimi Sono stati individuati 6 tipi fondamentali di reazioni enzimatiche: OSSIDOREDUTTASICHE (trasporto di elettroni) TRANSFERASICHE (trasferimento di gruppi) IDROLASICHE (scissione) LIASICHE (prevedono formazione o scissione reversibile di legami) ISOMERASICHE (isomerizzazione del substrato) LIGASICHE (sintesi unidirezionale di legami) Sono di conseguenza state individuate 6 classi di enzimi, una per ciascuna delle reazioni suindicate. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Classificazione degli enzimi Ogni enzima è classificato con un codice a 4 cifre: a. b. c. d a: si riferisce alla classe (reazione catalizzata, es. 4. liasi) b-c: si riferiscono alla modalità della catalisi e individuano la sottoclasse e la sotto-sottoclasse d: numero di serie dell’enzima all’interno della sotto-sottoclasse. Consideriamo ora una classificazione ordinata Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 1. OSSIDOREDUTTASI Trasportano unità riducenti, (H+)+(e-) La sottoclasse indica il donatore dell’H o altre unità riducenti (es. alcooldeidrogenasi). I vari numeri indicano i vari tipi di substrato che possono donare unità riducenti. Il 3° numero indica l’accettore delle unità riducenti (es. alcooldeidrogenasi: accettori sono enzimi del metabolismo lipidico oppure citocromi, il numero progressivo individua la reazione). Il 4° numero indica il numero di serie nella sotto-sottoclasse. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

1. OSSIDOREDUTTASI: coenzimi Le ossidoreduttasi sono proteine coniugate (apoenzima + coenzima). Il coenzima deriva dalla trasformazione da una vitamina oppure è una struttura che la cellula è in grado di prodursi: per esempio le strutture tetrapirroliche del protoemo nei citocromi. Nel dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione di ossidoriduttasi di tipo: PIRIDINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA PP) FLAVINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B2 ) CHINONICO (coenzima derivato dalle VITAMINE Q, E, K ) PTERINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B8 ) VITAMINA C DIPENDENTI Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

OSSIDOREDUTTASI con coenzima PIRIDINICO (NAD+ e NADP +) I coenzimi piridinici utilizzati da questa classe di ossidoreduttasi derivano dalla vitamina PP Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry VITAMINA PP -OH Ne sono dipendenti molti animali e molti eucarioti. E’ l’eterociclo della piridina che in posizione 3 ha un gruppo amidico Si tratta dell’amide dell’acido nicotinico [1]: dopo l’assunzione abbiamo l’idrolisi del legame amidico e quindi liberazione dell’acido nicotinico [2] che servirà per la sintesi del coenzima. In caso di deficienza soltanto le cellule animali hanno selezionato un sistema di supporto che utilizza gli intermedi del metabolismo del triptofano per sintetizzare un acido dicarbossilico ciclico: l’acido chinolinico [3]. [1] NH3 [2] [3] Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [1] Per la costruzione del coenzima sono necessari l’eterociclo della piridina, mono o disostituito con il carbossile (ACIDO NICOTINICO O CHINOLINICO). Inoltre è necessario, un saccaride, il RIBOSO. Si ottiene nella forma fosforilata sulla posizione 5 e con difosforilazione con l’anidride esterna dell’acido fosforico sulla posizione 1. 5 1 ACIDO NICOTINICO RIBOSO-5-FOSFATO-1-PIROFOSFATO Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [2] In questi enzimi avremo quei metalli di transizione (Me) che sono in grado di dare legami dativi con l’atomo di ossigeno che in seguito diventano legami covalenti: questo effetto si compie sull’O legato al C1 del riboso: viene sottratta la struttura pirofosforica sulla posizione 1 su cui compare una carica +: il C1 diventa C+, in contemporanea si ha una inversione di configurazione del C1 da a a b. Il C1+ può quindi ricevere attacco nucleofilo dal N1 del substrato (acido nicotinico o acido chinolinico). Si forma il prodotto di addizione e viene eliminato del pirofosfato (PPi). + + PPi Me Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [3] La struttura che si forma è costituita da un pentoso legato all’acido fosforico (in posizione 5 del riboso) e ad un’eterociclo azotato (o base azotata) tramite legame del C1 del riboso con l’N1 dell’eterociclo. Possiamo definire questa struttura un nucleotide: il nicotinato mononucleotide (NMN) oppure il chinolinato mononucleotide (CMN). CMN NMN Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [4] Il chinolinato mononucleotide viene ulteriormente modificato da un metalloenzima Mn dipendente che riconosce il COOH in posizione 2 dell’eterociclo e lo sottrae sotto forma di CO2, generando quindi il nicotinato mononucleotide che serve per la formazione del coenzima funzionale. Mn + CO2 Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [5] La sintesi del coenzima prevede una ulteriore reazione del nicotinato mononucleotide con ATP: un Mn enzima riconosce l’ossigeno del legame di anidride che collega il Pa con il Pb e destabilizza il legame tramite la transizione dativo-covalente dell’interazione Mn-O. Il Pa diventa sede di una carica + su cui da attacco nucleofilo uno degli atomi di ossigeno del fosforile del nicotinato. Quando il legame Mn-O ritorna dativo si libera pirofosfato e il prodotto di condensazione: il nicotinato adenin dinucleotide, ossia la forma desaminata del NAD+ (dNAD+). Mn Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [6] Per ottenere la forma attiva del coenzima (NAD+) si ha la seguente reazione:  dNAD+ + ATP + Q  ADP + Pi +E + NAD+ La reazione si basa sulla destabilizzazione del legame amidico della glutammina (Q) che viene scomposta a acido glutammico e un gruppo amminico che si trasferisce sul carbossile dell’acido nicotinico che torna quindi a formare una nicotinamide. Si ottiene il primo coenzima piridinico attivo, il NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE (NAD+).  dNAD+ NAD+ Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [7] L’altro coenzima piridinico attivo si ottiene dal NAD+ tramite fosforilazione della posizione 2 del riboso legato all’anello purinico dell’adenina.  NAD+ + ATP  ADP + NADP+  I due coenzimi hanno identico meccanimo di azione ma sono caratterizzati da un differente pH isoionico ed isoelettroco, poiché uno (il NADP+ ) contiene un gruppo fosforilico e ha quindi una carica netta negativa maggiore. Questi coenzimi interagiranno quindi con proteine che simmetricamente un diverso pH isoelettrico ed eventualmente cariche positive complementari a quelle del coenzima. Alcune apoproteine si legheranno in modo specifico al NAD+ e altre al NADP+ a formare differenti oloenzimi ossidoreduttasici piridinici. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Struttura trimensionale del coenzima * La molecola da un punto di vista spaziale risulta ripiegata intorno ad un asse in corrispondenza dell’O che connette i due gruppi fosforici. I due eterocicli si trovano su piani affacciati e paralleli. Tra i due piani si collocano i metalli cofattori, ioni metallici bivalenti (Ca2+ Mg2+ Mn2+ ), effettori della catalisi, che danno 4 coordinazioni con gli atomi indicati dagli asterischi * Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry Effetto catalitico I metalli cofattori catalizzano il trasporto di elettroni reversibile da un eterociclo all’altro: la adenina transisce dalla forma lattimica alla forma semilattamica, e questo effetto, amplificato dai metalli cofattori si trasmette alla piridina, che verrà a trovarsi in 2 possibili forme di risonanza: la aromatoide e la chinoide. + H + elettrone + aromatoide chinoide Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry Effetto catalitico La transizione scatenata dall’equilibrio tra le due forme di risonanza fa sì che sulla posizione 4 si concentri la carica positiva portata in precedente dall’N e che possa essere fissato in 4 un atomo di idrogeno in più mentre un elettrone viene accettato dal sistema delocalizzato degli anelli. Si forma pertanto una struttura neutra. Le ossidoreduttasi che contengono questi coenzimi operano reversibilmente, catalizzando la riduzione o l’ossidazione dei substrati. ossidazione NAD+ NADP+ NADH + H+ NADPH + H+ + XH2 X + riduzione La catalisi è stereospecifica: il substrato interagisce con il coenzima solo solo se si trova in una conformazione sterica appropriata. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Interazione coenzima-apoproteina L’interazione con la proteina è esclusivamente salina Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Struttura trimensionale del coenzima * La molecola da un punto di vista spaziale risulta ripiegata intorno ad un asse in corrispondenza dell’O che connette i due gruppi fosforici. I due eterocicli si trovano su piani affacciati e paralleli. Tra i due piani si collocano i metalli cofattori, ioni metallici bivalenti (Ca2+ Mg2+ Mn2+ ), effettori della catalisi, che danno 4 coordinazioni con gli atomi indicati dagli asterischi * Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry Vitamina B2 Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry