mitochondria-caspase 9 Classification of cell death Cell death Necrotic Caspase-dependent Caspase-independent receptor-caspase 8 mitochondria-caspase 9

Il segnalamento apoptotico

Two lymphocytes Staurosporin-treated HeLa cells Healthy Apoptotic Apoptosis Apoptosis Weinberg Fig 9.18 Different parts of the apoptotic programme. Markers for the process. Fragmentation of DNA Apoptotic cell Pyknotic nuclear fragments Phagocytosis of apoptotic bodies Fragmentation of Golgi bodies Phosphorylation of Histone 2B

Apoptosi: frammentazione del DNA Caratteristiche morfologiche associate a morte cellulare che portano alla dissoluzione della cellula e alla fagocitosi. Caratteristiche biochimiche associate a morte cellulare Frammentazione del DNA a livello internucleosomale con formazione di frammenti di 200bp e multipli Alterazione della compartimentalizzazione di lipidi di membrana con esposizione della fosfatidilserina e altre proteine riconosciute dai fagociti Apoptosi: frammentazione del DNA

Attivazione di una cascata di proteasi (CASPASI) APOPTOSI Via estrinseca o citoplasmatica recettori della morte Fas:fasL Via intrinseca o mitocondriale rilascio di citocromo C Famiglia Bcl-2 Via finale comune: Attivazione di una cascata di proteasi (CASPASI) bid Proteolisi di molecole regolatorie e strutturali

L’apoptosi può cominciare a seguito di diversi stimoli quali: 1. Deprivazione di fattori di crescita 2. Radiazioni UV e g 3. Chemioterapici 4. Recettori della morte (famiglia TNFR) I RECETTORI DELLA MORTE TNF-R1 (CD120a) CD95 (APO-1:Fas) DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSL1) TRAIL-R1 (APO-2, DR4) TRAIL-R2 (DR5, KILLER, TRICK2) DR6 possiedono un dominio intracellulare definito “death domain” (DD), essenziale per la trasduzione del segnale apoptotico DD MEMBRANA CELLULARE

Segnalamento apoptotico-Ruolo della Matrice Extracellulare I ligandi dei recettori della morte sono trimeri di membrana che vengono rilasciati da metalloproteinasi di matrice (MMPs) LIGANDI: TNFa prodotto da monociti/macrofagi TWEAK (APO-3L) FasL FasL-Fas system = linfociti T citotossici Linfotossina (LTa, LTb) prodotti da linfociti attivati LIGHT TRAIL (APO-2L) TNFa TNFR MMP MMP

A seguito della trimerizzazione i recettori della morte legano tramite i domini DD delle “molecole adattatrici”: FADD/Mort1 Fas-Associated-Death-Domain protein RIP Receptor-Interacting-Protein TRADD TNF-Associated-Death-Domain protein

FADD RIP TRADD

Legame di FASL al suo recettore Induzione di trimerizzazione Reclutamento di Fadd e di caspasi 8 (DISC: death-inducing signalling Complex) Attivazione di caspasi 8

Il segnalamento apoptotico - Gli enzimi “Caspasi” Le caspasi vengono divise in iniziatori e effettori. Le proteine adattatrici legano le caspasi “iniziatrici” connettendo il recettore al “macchinario apoptotico effettore” costituito da una sequenza di caspasi DED = Death Effector Domain Caspasi-10 - 8 DEDD TRADD FADD RIP CARD = Caspase Recruitment Domain Caspasi-9 - 4 - 2 - 1 APAF = Apoptopic Proteases Activating Factors Caspasi-7 - 6 - 3 Effettori Apoptotici Caspasi-14 - 13 - 12 - 11 -5 Processamento di citochine prima della secrezione

Tutte le caspasi sono sintetizzate come zimogeni, e necessitano di essere attivate da taglio proteolitico. L’enzima attivo è un eterotetramero formato da 2 subunità catalitiche di circa 20 kDa e da 2 subunità di circa 10 kDa FADD Pro-Caspasi-8 Attivazione autoproteolitica Caspasi 8

TNF TNFR FADD TRADD TRAF APOPTOSI Caspasi-3/6/7 Caspasi-8 Le caspasi iniziatrici attivano le esecutrici eventualmente portando la cellula in apoptosi Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR APOPTOSI Pro-Caspasi 3/6/7 Caspasi-3/6/7 Caspasi-8

(X-chromosome-linked inhibitor apoptosis protein ) Survivin ML-IAP Le IAP (inhibitor of apoptosis) costituiscono una importante classe di regolatori dell’apoptosi IAP-1 e IAP-2 XIAP (X-chromosome-linked inhibitor apoptosis protein ) Survivin ML-IAP Bruce Livin cIAP-1 e -2 si legano ai TRAFs (TNF-receptor associated factors) 1 e 2 Survivin é implicata nel controllo del ciclo cellulare XIAP inibisce le caspasi-3, -6 e -7 ML-IAP inibisce le caspasi-3, -7, -9 Legano le procaspasi per prevenirne l’attivazione Inizialmente descritte come prodotti virali (p35 di baculovirus) Contengono delle sequenze ripetute che legano I metalli (~80aa) BIR repeats Il numero e la sequenza dei of BIR’s detrmina la specificita’ dell’inibizione della of procaspasi Alcuni contengono RING fingers Modulatori delle IAP Inibitori degli inibitori Smac/Diablo

DIMERI La famiglia delle proteine Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2) Più di 30 regolatori dell’apoptosi, comprendono INIBITORI e PROMOTORI Si localizzano sulla membrana mitocondriale esterna, del reticolo endoplasmico e del nucleo Inibitori di apoptosi: Bcl-2 Bcl-XL Bcl-xs A1 Boo Mcl-1 Promotori di apoptosi: Bax Bak Bok Bad Bim/Bod Bid Bik/Nbk/Blk Bmk Hrk/DP5 Noxa Puma/Bbc3 DIMERI Proteine anti- e pro-apoptopiche formano eterodimeri regolatori. I livelli relativi di queste proteine possono decidere se la cellula muore o sopravvive

Il segnalamento apoptotico – La famiglia delle proteine Bcl-2 Pro-Sopravvivenza Famiglia Bcl2 Bcl-XL Bfl-1 Bcl-W Mcl1 (“formatori di canali/pori mitocondriali”) Pro-Apoptosi Famiglia Bax Bak Bok Possiedono i cosiddetti domini di omologia a Bcl-2 (BH1, BH2, BH3) La famiglia comprende membri anti- e pro- apoptotici I domini BH interagiscono con domini omologhi, creando oligomeri fra proteine pro ed anti-apoptotiche. Possiedono domini transmembrana che permettono l’inserimento nelle membrane (incluse le membrane mitocondriali esterne) Esercitano il loro effetto sulla permeabilita’ delle membrane mitocondriali esterne Famiglia BH3-only (“sentinelle dell’apoptosi”) Bid Bad, Bim, Bik, Bmf, Hrk, Noxa, Puma

Iniziazione dell’apoptosi Bad, Bim and Bid sono mantenute inattive in cellula e, se attivate da segnali citotossici, si legano ad altre proteine apoptotiche Cellula sana Iniziazione dell’apoptosi Membrana Mitocondriale esterna Deprivazione di Mitogeni Transienti di [Ca2+] Taxolo Deprivazione di mitogeni

Effetti pro-apoptotici del Calcio Bad P SOPRAVVIVENZA Apaf-1 14-3-3 sequestra BAD Bad MORTE Fosfatasi Calcineurina Apaf-1 Chinasi Akt/PKB PKA

Le “BH3-only” nell’attivazione dell’apoptosi Segnale apoptotico Bid. Bad. Bim. Bik. Bmf. Hrk. Noxa. Puma. Cyto C BH3 only

Mitocondrio ATP APOPTOSOMA Molti stimoli apoptotici sono in grado di avviare l’apoptosi attraverso una via mitocondriale Mitocondrio Cyto-C APAF-1 card Bcl-2 Rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrane e rilascio di Apaf-1 (Apoptopic Proteases Activating Factor) che smaschera il dominio CARD di Apaf-1 Cyto-C APAF-1 card Radiazioni, stress DEX, staurosporina deprivazione mitogeni Ceramide p53 Procaspasi-9 Cyto-C APAF-1 card caspasi-9 APOPTOSOMA ATP

tBid Bid tBid tBid tBid tBid Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 1 Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR Il citocromo c è rilasciato anche a seguito di attivazione dei recettori della morte a causa dell’attivazione di Bid da parte di caspasi 8 Bcl-2 Bcl-xL Bax tBid Neutralizzazione di Bax o Bak Bcl-2 Bcl-xL Cyt C Bid tBid Bax Bak tBid Bak tBid Bax Bak tBid Bax Cyt C

Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 2 – il PTP Pro-Caspasi-8 FADD TRAF TRADD TNF TNFR Il cit c è rilasciato anche attraverso il PTP. Dal mitocondrio vengono rilasciati anche Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 e AIF Bcl-2 Bcl-xL Bax Bid tBid Bak AIF VDAC ANT PTP Cyt C Cyt C Anti-apoptotic Bcl-2 family members interact with and close the VDAC, whereas some, but not all, proapoptotic members interact with VDAC to open protein-conducting pore through which apoptogenic factors pass. Although the VDAC is involved directly in breaking the mitochondrial membrane barrier and is a known component of the permeability transition pore complex, VDAC-dependent increase in outer membrane permeability can be independent of the permeability transition event such as mitochondrial swelling followed by rupture of the outer mitochondrial membrane. Omi/HtrA2 Omi/HtrA2 Omi/HtrA2 = serina-proteasi Smac/Diablo Smac/DIABLO = second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP-binding protein with low pI Smac/Diablo AIF AIF = Apoptosis Inducing Factor (attivatore di endonucleasi) canale anionico voltaggio-dipendente traslocatore di adenin nucleotide

apoptosi sopravvivenza Smac/Diablo Omi/HtrA2 Smac/DIABLO = second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP-binding protein with low pI Omi/HtrA2 = serina-proteasi

ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell’O2 ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell’O2. Alcuni di loro tipo O2•- (anione superossido) e OH•- (radicale idrossilico o ossidrile), possono essere definiti come veri radicali liberi. Altri ROS, tipo H2O2, sono più propriamente pro-ossidanti. O2•-, •OH- e H2O2 sono i ROS più rilevanti in condizioni fisiologiche e patologiche Mitocondri Circa il 1-5% degli elettroni che “fluiscono” nella catena respiratoria possono essere dirottati a realizzare O2•- a livello del complesso I (NADH/ubiquinone ossidoriduttasi) e complesso III (ubiquinol/citocromo c ossidoriduttasi). O2•- viene poi convertito da SOD mitocondriale in H2O2, che si riversa nel citoplasma. NADPH ossidasi NOX è costitutivamente attivo e produce livelli molto bassi di ROS; in risposta a vari fattori cellulari l’attività di NOX aumenta e aumenta la produzione dei ROS SOD superossido dismutasi

ROS modulano la funzione di molti enzimi (box) e fattori di trascrizione (ovali) tramite molti segnalamenti intracellulari. Questi segnali cambiano l’espressione genica influenzando la sopravvivenza ela morte HSF1, heat shock transcription factor 1 Lo stress ossidativo attiva numerose e importanti vie di trasduzione dei segnali ROS producono effetti diversi in base alla severità del danno, al tipo di cellula e alla durata dell’esposizione. In genere, basse dosi di ROS, in particolare perossido d’idrogeno, sono mitogenici e promuovono la proliferazione cellulare; dosi intermedie provocano un temporaneo o permanente blocco della crescita