Istituto di Biologia e Genetica Università Politecnica delle Marche Istituto di Biologia e Genetica Lo splicing dell’RNA definizione importanza predizione Francesco Piva

Struttura tipica dei geni umani esoni introni

SPLICING eliminazione introni unione esoni esone1 introne1 esone2 GT AG GT AG SPLICING eliminazione introni introne1 introne2 esone2 esone3 esone1 unione esoni esone1 esone2 esone3

Lo splicing avviene in tutto il trascritto, anche nelle zone non codificanti

Segnali per il riconoscimento degli introni Motivi conservati

I segnali dei siti di splicing sono ben conservati tra le specie probabilmente la comparsa del meccanismo di splicing è molto antica

Meccanismo dello splicing

U2AF si lega al tratto pirimidinico a valle del sito di ramificazione Arg-Ser arly snRNP U2 si lega al sito di ramificazione (richiesta idrolisi ATP) U2AF U2AF il 3’ss è tagliato e gli esoni vengono saldati insieme, il cappio verrà deramificato le prot SR connettono U2Af con snRNP U1 si legano insieme U2AF U2AF snRNP U5 si lega al 5’ss, snRNP U6 si lega a snRNP U2 snRNP U4 è rilasciato (richiesta idrolisi ATP), snRNP U6 e U2 catalizzano la transesterificazione, snRNP U5 si lega al 3’ss, il 5’ ss è tagliato e si forma il cappio snRNP U1 è rilasciato, snRNP U5 si sposta dall’esone all’introne, snRNP U6 si lega al 5’ss

introne (5’ss)

snRNP U1 Sm protein

RBD: RNA binding domain C5

snRNP U2 Sm protein si appaiano con snRNA U6 si appaia al sito di ramificazione

U17 U5

Lo splicing è tessuto specifico 1 2 3 5 Muscolo cardiaco 1 2 3 4 5 1 4 3 5 Muscolo uterino

Esempio di alternative splicing di un gene umano

Alternative splicing tessuto specifico

Alcuni modi di fare splicing alternativo

Alcuni genomi virali subiscono splicing all’interno della cellula ospite

equine infectious anemia virus (EIAV)

Effect of synonymous variations at CERES in CFTR exon 9 WT 5’-ACAGTTGTTGGCGGTTG-3’ point mutations TACCACCC TTATT GGTTC AA CCGC G G T Q452P 100 90 80 V456EF 70 % exon 9 inclusion 60 50 40 30 A455E 20 10 A G T G A G T C T C G C A C A C A C C T T C A G T T C T WT 144A 145C 146A 147G 148T 149T 150G 151T 153G 154G 155C 156G 157G ex9+ ex9- Pagani, F., Buratti, E., Stuani, C., and Baralle, F. E. (2003) J Biol Chem Pagani, F., Stuani, C., Zuccato, E., Kornblihtt, A. R., and Baralle, F. E. (2003) J Biol Chem 278, 1511

The majority of random substitutions at the synonymous codons in CFTR exon 12 induce exon inclusion/1 WT AAA GAT GCT GAT TTG TAT TTA TTA GAC TCT CCT TTT GGA A1 AAG GAC GCA GAT TTG TAC TTA TTA GAT TCA CCC TTC GGA A2 AAG GAC GCG GAC TTG TAT TTA TTA GAT TCG CCG TTC GGC A3 AAA GAC GCT GAT TTG TAC TTA TTG GAT TCA CCG TTC GGA A4 AAG GAC GCG GAC TTG TAC TTA TTG GAC TCC CCC TTC GGT A5 AAG GAC GCC GAC TTG TAT TTG TTG GAC TCT CCG TTC GGT A6 AAG GAC GCC GAC TTA TAC TTG TTG GAC TCG CCT TTT GGC A7 AAA GAC GCG GAT TTG TAT TTA TTG GAT TCA CCT TTC GGC A8 AAA GAC GCA GAT TTA TAT TTG TTG GAC TCC CCG TTT GGA A9 AAA GAT GCC GAC TTA TAT TTG TTG GAT TCA CCC TTC GGC A10 AAG GAC GCT GAC TTG TAT TTA TTG GAC TCC CCA TTT GGG A11 AAA GAC GCA GAC TTG TAT TTG TTG GAC TCA CCG TTC GGT A12 AAA GAC GCA GAC TTA TAC TTA TTG GAC TCA CCG TTT GGT A13 AAA GAC GCA GAT TTG TAT TTA TTG GAT TCT CCG TTT GGG A14 AAA GAT GCG GAC TTG TAT TTA TTG GAT TCG CCA TTT GGT A15 AAG GAT GCT GAT TTA TAT TTA TTA GAC TCT CCG TTC GGT A16 AAA GAT GCG GAT TTG TAT TTG TTA GAC TCA CCG TTT GGC A17 AAA GAC GCA GAT TTA TAC TTG TTG GAT TCC CCC TTC GGC A18 AAA GAT GCA GAT TTG TAC TTG TTA GAC TCG CCC TTT GGC A19 AAG GAC GCA GAT TTG TAT TTG TTA GAC TCC CCA TTC GGG A20 AAG GAC GCT GAC TTA TAC TTG TTA GAT TCC CCT TTC GGT A21 AAG GAT GCA GAT TTA TAT TTA TTA GAC TCC CCT TTT GGT A1->12 A13->17 A18->20 A21 WT Changes in splicing efficiency are not related to the use of unpreferred synonymous codons (underlined) Nucleotide changes have different effect according to the context in which they occur

Intron definition / exon definition

Modello di exonic splicing enhancer mediato da proteine SR

Modello di exonic splicing silencer

Ricombinazione e splicing alternativo In presenza di una struttura interrotta, mutazioni neutre possono originare nuove forme di alternative splicing senza distruggere le forme funzionali già esistenti. Questa rappresenta un’opportunità per l’evoluzione di esplorare nuovi schemi aggiungendoli eventualmente a quelli precedenti. (Pagani F, Raponi M, Baralle FE. Synonymous mutations in CFTR exon 12 affect splicing and are not neutral in evolution Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 3;102(18):6368-72.)

Molte altre proteine partecipano allo splicing 9G8, CUG-BP1, DAZAP1, ETR-3, Fox-1, Fox-2, hnRNP-A0, hnRNP-A1, hnRNP-A2/B1, hnRNP-C, hnRNP-D, hnRNP-D0, hnRNP DL, hnRNP E1, hnRNP E2, hnRNP-F, hnRNP G, hnRNP-H1, hnRNP-H2, hnRNP-I, hnRNP J, hnRNP K, hnRNP-L, hnRNP M, hnRNP P (TLS), hnRNP Q, hnRNP U, HTra2beta1, HuB, HuD, HuR, KSRP, Nova-1, Nova-2, nPTB, PSF, Sam68, SC35, SF1, SF2/ASF, SLM-1, SLM-2, SRp20, SRp30c, SRp38, SRp40, SRp54, SRp55, SRp75, TDP43, TIA-1, TIAL1, YB-1 …

ESE, ISS: esone ESS, ISE: introne

Pan troglodytes average nucleotide divergence of just 1.2%

Letture consigliate Nature reviews. Genetics. 2002; 3(4): 285-298 Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. PMID: 11967553 Nature reviews. Genetics. 2007; 8(10): 749-761. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Wang GS, Cooper TA. PMID: 17726481