Meccanismi d’azione del fitocromo Regolazione espressione genica: Componenti del “photosynthetic machinery” sono regolati dalla luce, spesso tramite Phy Attivazione di geni targets, mediante interazione con TFs, quali PIF3, HY5, DOF... Percezione segnale Trasduzione segnale Network trascrizionale Variazioni espressione Fotomorfogenesi R FR dark light

I Pathways attivati da phyA/B......... Identificazione delle molecole poste a valle di phyA/B: approccio genetico approccio cellulare/biochimico Approccio Genetico screening per mutanti nel/i fitocromo/i e nel signalling del/i fitocromo/i identificazione di 2 classi di mutanti: cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca) hy (long hypocotyl)

cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca): LUCE BUIO cop wt cop wt hy (long hypocotyl): LUCE hy wt

cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca): mutanti deeziolati anche se cresciuti al buio, risposte al segnale luminoso costitutivamente accese mutazioni recessive  le proteine Wt sono regolatori negativi che agiscono al buio x reprimere la fotomorfogenesi hy (long hypocotyl): fenotipo alla luce ≈ plantula cresciuta al buio, risposte al segnale luminoso ridotte o nulle Mutanti nel cromoforo: ipocotile allungato in luce W ipocotile allungato in condizioni di luce l-specifiche Mutanti in uno specifico fitocromo: Mutanti in un regolatore positivo (hy5): ipocotile allungato in luce W, R. FR, blu

Effetti fenotipici delle mutazioni cop/det Fenotipo al buio Germinazione Phy-mediated Lungh.ipocotile Espansione cotiledoni Sviluppo foglie Differenz. Cloroplasti Accumulo antociani Induzione geni luce-regolati + - ? + + lungo corto corto corto corto - + + + + - + - - - - + - + + - ++ ++ ++ ++ normale normale ritardato anticipato letale normale nano nano nano max4 fog. WT det1 det2 cop1 cop9 Fenotipo alla luce Fioritura Altezza pianta

Fattori nucleari coinvolti nel pathway fitocromo COP1: funziona da E3 ubiquitin-protein ligasi, targeting proteine specifiche per la degradazione mediante ubiquitinazione. Agisce come repressore, antagonista di HY5 COP9: “signalosome complex” (11 fattori) responsabile della degradazione di proteine ubiquitinate HY5: bZip TF, target 1°ario di questo pathway; lega le G-box sui promotori luce-regolati. Il livello steady-state del suo mRNA è mantenuto basso al buio mediante ubiquitinazione (COP1) e azione del complesso COP9 DET1: elemento di biosintesi dei Brassinosteroidi, ormoni steroidei vegetali, che mimano parte degli effetti mediati dalla luce DET2: putativo fattore di remodeling della cromatina

PIF3: fattore di trascrizione bHLH, localizzato costitutivamente nel nucleo, lega in modo luce-dipendente e Phy-dipendente, i promotori di geni luce regolati interagisce sia con PhyA che con PhyB, ma l’interazione è 10x > con PhyA poc1: mutante knock-on nel promotore di PIF3, aumentata risposta a luce R PIF4: altro fattore di trascrizione, PIF3-like, interagisce con PhyB Pfr

Meccanismi d’azione del fitocromo Regolazione intercellulare phy-mediata: Alcune risposte di crescita/sviluppo sono molto rapide e probabilmente mediate da variazioni inter-intracellulari di ioni/metaboliti (meccanismo citosolico di crescita/omeostasi)

Single-cell assays: Approccio Cellulare-Biochimico Microiniezione in cellule WT & del mutante aurea (phyA-, tomato) Aurea manca di PhyA attivo mentre PhyB è normale Cellule dell’ipocotile di aurea non sviluppano cloroplasti ne’ antociani in risposta alla luce a differenza del WT Mutante aurea complementato da microiniezione di PhyA esogeno: sviluppo cloroplasti, sintesi antociani e induzione di un gene reporter fotoregolato (Pr.light/GUS)

Reazioni controllate da Phy a livello cellulare: Regolazione genica Sviluppo dei cloroplasti (PSII, PSI) Biosintesi degli antociani Agonisti: GTPgS (GTP analogo), subunità A di cholera toxin (GTP analogo), 8Br-cGMP (cGMP analogo), Calcium, CaM Antagonisti: GTPbS, Rp-8Br-cGMPS

cGMP attiva espressione di chs in cellule WT al buio 1 3 7 10 Dark 8Br-cGMP Rp-8Br-cGMPS - Analogo cGMP attivo inattivo ATP syn Cyt.b6f 1 2 3 5 7 9 11 Luce (ore) cab fnr atp g rieske rbcS chs PSII antho PSI stroma Complessi fotosintetici

G CGMP Anthocyanin (chs) phyA PSII Cyt.b6f Choloroplast development LHCI/II ATPsynth. RUBISCO Ca2+ CaM G: heterotrimeric G proteins, switch molecolari che cambiano conformazione da una forma attiva GTP-legata ad una GDP-legata inattiva

Il sistema agisce modulando l’espressione di geni a livello nucleare FTs attivati da Ca2+, caM, cGMP, i due segnali sono generati separatamente i targets dei 2 pathways sono geni distinti anche i prodotti finali (outputs) sono distinti

LIGHT G protein Pr Pfr Pfr* PKS PK pathway Ca2+ Pfr PIF3 DET/COP