Analisi della Funzione genica nelle piante Genomi Vegetali Arabidopsis thaliana come sistema modello molecolare Fattori trascrizionali vegetali I geni MADS Geni omeotici vegetali: il modello ABC Analisi della Funzione genica nelle piante Il sistema Agrobatterio: dalla natura alle applicazioni Elementi trasponibili vegetali: dalla natura alle applicazioni Collezioni di mutanti inserzionali Genetica Forward: dall' isolamento di un mutante all'identificazione del gene mutato Genetica Reverse: isolamento di un mutante inserzionale nel gene d'interesse Sistemi di Regolazione nelle piante Meccanismi epigenetici Silenziamento genico trascrizionale (TGS) Silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) Regolazione epigenetica del processo di flowering Regolazione post-trascrizionale: siRNA e RNA nelle piante Regolazione post-traduzionale: il Proteosoma Network e Crosstalk di regolazione genica Il pathway di regolazione mediato dal fitocromo (fotorecettore della luce)

come sistema modello della biologia molecolare Arabidopsis thaliana come sistema modello della biologia molecolare delle piante

Perché gli organismi modello? Cos’è un organismo modello? Tutte le metodologie genetiche e molecolari, possono funzionare più o meno bene a seconda delle specie. Per esempio è molto più facile ottenere informazioni molecolari sulla struttura o sull’ espressione di un dato gene in un organismo con un genoma piccolo e compatto, piuttosto che grande e ridondante. Allo stesso modo nessuna informazione sarebbe affidabile in un organismo che presenta una grande variabilità allelica; al contrario in molte specie di laboratorio sono state stabilizzate linee isogeniche.

Per effettuare analisi genetiche, poi, bisogna considerare il tempo di generazione; è evidente che specie vegetali che fioriscono e sviluppano lentamente, sono improponibili per studi genetici. Importante è anche la disponibilità di informazioni genetiche e molecolari, come la conoscenza della sequenza genomica e la disponibilità di marker di ricombinazione. Per questo la ricerca biologica si concentra su organismi selezionati definiti “sistemi modello” che presentano caratteristiche adatte a studi molecolari, fenotipici e genetici. L’uso di specie modello si basa sull’assunto che molte delle loro caratteristiche biologiche sono condivise e conservate in molte altre specie del regno.

Oltre ad un alto grado di conservazione di sequenza per molti geni, nell’ambito del regno vegetale, la genomica comparata ha rivelato un alto grado di conservazione della struttura genica (sintenia) fra gruppi strettamente correlati da un punto di vista tassonomico. Le nostre attuali conoscenze sulla sintenia indicano che, nonostante la plasticità che contribuisce alla diversità/evoluzione dei genomi vegetali, l’organizzazione genica è mantenuta in ampi tratti dei cromosomi. Ciò faciliterà i progressi biotecnologici che mirano all’inserimento di geni utili in piante da raccolto. Segmenti genomici di Arabidopsis presentano ampia colinearità con regioni genomiche di generi correlati come Brassica ma anche con specie molto più distanti filogeneticamente.

L’importanza dei sistemi modello Puya raimondii è un pessimo sistema modello: Fiorisce ogni 100 anni e raggiunge i 10 metri di altezza. Non si conosce nulla della sua genetica e del suo genoma Arabidopsis thaliana è un buon sistema modello: fiorisce dopo 1 mese, raggiunge i 30-50 centimetri di altezza e cresce bene in laboratorio.

eletta pianta modello su 250000 piante Arabidopsis thaliana eletta pianta modello su 250000 piante Perché Arabidopsis??? “generation time” molto breve: un ciclo vitale in 5/6 settimane taglia piccola genoma nucleare piccolo, distribuito su 5 cromosomi produzione di un gran numero di “eredi” poco DNA ripetuto facilmente trasformabile ad alta efficienza

QUINDI: Ampia disponibilità di banche YAC, BAC, etc.. Consorzio AGI per sequenza genoma Disponibilità di markers molecolari, genetici Numerose collezioni di mutanti chimico/fisici Numerose collezioni di mutanti inserzionali (Genetica Forward/Reverse)

Fabaceae Arabidopsis thaliana Brassicaceae Brassica oleracea Vitaceae Glycine max Pisum sativum Phaseolus vulgaris Medicago trunacatula Medicago sativa Brassicaceae Arabidopsis thaliana Brassica oleracea Eudicots Solanaceae Monocots Vitaceae Gymnosperms Angiosperms 150/300 Myr Sorghum bicolor Zea mays Hordeum vulgare Triticum aestivum Oryza sativa Graminaceae 450/700 Myr

Come Arabidopsis è diventata un modello…… Studi genetici e citogenetici sono iniziati subito dopo la riscoperta dei principi della genetica all’inizio dell’ultimo secolo Nel 1907 era già noto che Arabidopsis aveva solo 5 cromosomi Nel 1937 Arabidopsis è stata studiata per gli effetti della luce sul flowering e la dormienze dei semi Anche la grande variabilità naturale in tratti fisiologici nei diversi ecotipi era di interesse Nel 1943 Arabidopsis è stata proposta come modello per la genetica e la biologia dello sviluppo Nel 1947 è stato dimostrato che le mutazioni con raggi X producevano mutazioni nel genoma di Arabidopsis

Nel 1965 c’è stata la “First International Conference” Ciò nonostante l’ampio sviluppo di Arabidopsis come sistema modello risale ai primi anni ‘80 Il primo paper su Arabidopsis come sistema modello della biologia molecolare delle piante è del 1987 (Meyerowitz) Mappe RFLP e librerie di cosmidi e YACS sono state prodotte Nel 1992 sono stati clonati i primi geni per “positional cloning” Negli anni ‘80/’90 sono stati sviluppati i protocolli per la trasformazione genetica di Arabidopsis E’ stata così prodotta la prima collezione di mutanti inserzionali

Analisi del genoma di Arabidopsis The Multinational Coordinated Arabidopsis thaliana Genome Research Project (1990-2001) 1990 Obiettivi: Analisi del genoma di Arabidopsis Mutagenesi a saturazione e sviluppo di metodi per transposon tagging per definire funzionalmente quanti più geni possibile Creazione di librerie cDNA ed EST che rappresentino diversi tessuti e tipi cellulari Integrazione di mappe fisiche e genetiche Mappatura dei centromeri Sequenziamento dell’intero genoma 2001 Risultati: Disponibili più di 500.000 linee di mutanti sia chimici che inserzionali Più di 150.000 ESTs in banca dati; librerie di cDNA disponibili Mappa delle linee Inbred ricombinanti disponibili, usata per costruire mappe fisiche BAC,YAC e P1 nel 1997 Completamento della sequenza del genoma Dicembre 2000

Information Sharing & Database 1990 Obiettivi: Information Sharing & Database Sviluppo di un programma informatico che faciliti lo scambio dei risultati Sviluppo di Tecnologie per gli studi di Genomica Vegetale Nuove tecniche di trasformazione 2001 Risultati: TAIR: http://www.arabidopsis.org; AGR: http://ukcrop.net/agr/ Tecnologie di “infiltrazione sotto vuoto” e “floral dip”

Caratteristiche del genoma di A.thaliana genoma di 125 Mb circa 35% geni unici contiene circa 26.200 geni 37.5% geni che esistono come membri di famiglie geniche di almeno 5 geni mostra evidenze di una vecchia poliploidia: circa il 58-60% del genoma di Arabidopsis rappresenta un’ampia duplicazione per segmenti le regioni centromeriche, anche se ampiamente eterocromatiche, contengono almeno 47 geni espressi contiene circa 150 famiglie proteiche uniche di piante, di cui 16 sono famiglie di TFs