UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA ‘‘LA SAPIENZA’’ FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CLASSE DI LAUREA MAGISTRALE IN BIOLOGIA (6S) CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN NEUROBIOLOGIA TESI DI LAUREA STUDIO DELLE CORRENTI STRETCH-ATTIVATE NELLE CELLULE MICROGLIALI: PROPRIETA’ ELETTRICHE E CARATTERIZZAZIONE Candidato: Giordano Caterina Relatore Interno: Prof. De Stefano Maria Eagle N. Matricola: 678843 Dip. Di Biologia Cellulare e dello Sviluppo Relatore Esterno: Prof. Ragozzino Davide Dip. Fisiologia umana e Farmacologia Anno Accademico 2012-2013

LE CELLULE GLIALI --- MACROGLIA --astrociti --oligodendrociti e cellule di Schwann --- MICROGLIA cellule responsabili della risposta immunitaria che si ha in seguito ad un’infezione o insulto a carico del SNC. Nicola J. Allen and Ben A. Barres : Glia - more than just brain glue Nature,2009

FUNZIONI DELLE CELLULE MICROGLIALI Le cellule microgliali sono dei guardiani attivi e dinamici del parenchima cerebrale --- movimento tramite il riarrangiamento dei processi citoplasmatici --- stato di resting (forma ramificata) e stato attivato (forma ameboide) --- produzione e rilascio di citochine, chemochine, mediatori del processo infiammatorio

IL RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CLORO NELLA MICROGLIA IAA-94 FFA DIDS Cl- ClC-3? Il flusso dello ione cloro partecipa a diverse attività microgliali: --- regolazione del volume cellulare --- ramificazione, attivazione, migrazione, proliferazione, fagocitosi, apoptosi. Nilius B, Eggermont J, Voets T, Droogmans G. (1996): Volume activated Cl- channels. Gen. Pharmacol.; 27: 1131–1140. Eder C, Klee R, Heinemann U. (1998): Involvement of stretch-activated Cl- channels in ramification of murine microglia. The Journal of Neuroscience; 18(18):7127–7137.

Equazione di Goldman-Hodgkin e Katz IL CLORO PARTECIPA AL MANTENIMENTO DEL POTENZIALE DI MEMBRANA NELLE CELLULE MICROGLIALI --- canali ionici aperti in condizioni passive --- trasportatori Equazione di Goldman-Hodgkin e Katz Gli ioni sono sollecitati da due forze che tendono a farli spostare da un lato all’altro della membrana, una forza motrice chimica (gradiente di concentrazione) e una forza motrice elettrica (ddp ai due lati della membrana). Il valore del potenziale di membrana al quale queste 2 forze si eguagliano, viene definito potenziale di equilibrio per quello ione. ECl = RT/zF ln [Cl-]i /[Cl-]e. Equazione di Nernst

I CANALI IONICI PER IL TRASPORTO DEL CLORO ---- canali attivati da ligandi extracellulari (GABA-R e glicina-R) ---- canali attivati da ligandi intracellulari (CaCC) -----canali voltaggio-dipendenti ---- CFTR (cAMP-activated cystic fibrosis trans membrane conductance regulator) ---- canali attivati da stimoli sensoriali (attivati dallo stiramento (stretch) della membrana) La natura molecolare dei canali ionici stretch-attivati permeabili al cloro non è ancora chiara. Tra le proteine che potrebbero essere considerate come dei probabili candidati ci sono: ---Mdr o glicoproteina-P (Pgp), ---la proteina FXYD1, ---le proteine ClC (D’Anglemont et al,. 2003). --canali ionici --trasportatori

ClC-2 ClC-3 CANALI DEL CLORO STRETCH-ATTIVATI: FAMIGLIA GENICA ClC Nei mammiferi si distinguono nove geni ClC divisi in tre gruppi in base all’omologia di sequenza. I canali ClC-2 e ClC-3 sono stati proposti come possibili candidati dei canali del cloro stretch-attivati. ClC-2 --conduttanza anionica --voltaggio-dipendente ClC-3 --costitutivamente aperto --conduttanza anionica --assenza di un’identità molecolare per la mancanza di inibitori farmacologici specifici. D’Anglemont et al., (2003): Structure and pharmacology of swelling sensitive chloride channels, ICl,swell . Fundamental & Clinical Pharmacology.; 17: 539–553.

LA TECNICA ELETTROFISIOLOGICA DEL PATCH CLAMP B. Sakmann e E. Neher (premio nobel per la Fisiologia e Medicina 1991) Cell-attached Whole-cell

UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI DI FETTINE DI IPPOCAMPO 270 mOsm

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE FETTINE DI IPPOCAMPO VIENE INIBITA DAI BLOCCANTI DEI CANALI ANIONICI IAA-94 FFA IAA-94 DIDS

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO Cambiare scala AM? Levare numeri Ingrandire font

LA LINEA CELLULARE MICROGLIALE BV-2 Studio del movimento del cloro tramite tecniche di fluorescenza ---- funzioni cellulari (per es. riarrangiamento dei processi citoplasmatici) -- CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DELLA CORRENTE DI CLORO STRETCH-ATTIVATA -- MOVIMENTO DEL CLORO NELLE CELLULE BV-2 TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE DEL CLORO MEDIANTE TECNICHE DI IMAGING La misura diretta della concentrazione intracellulare del cloro nelle cellule , è resa difficile da due caratteristiche: un basso rapporto delle [Cl-] tra l’ambiente intracellulare ed extracellulare, approssimativamente 10:1 e una driving force molto ridotta ,in quanto il potenziale di inversione del cloro si avvicina molto al potenziale di riposo delle cellule. Piotr Bregestovski, Tatyana Waseem and Marat Mukhtarov,(2009); Genetically encoded optical sensors for monitoring of intracellular chloride and chloride-selective channel activity. Front. Mol. Neurosci. 2, 1-15. Cl- Cl- 1:10

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE MEDIANTE SONDE FLUORESCENTI SVANTAGGI ---eccitazione con UV. ---alta sensibilità alle variazioni del pHi. ---scarsa sensibilità di legame al cloro. --- tossicità. --- fluorofori di derivazione chinolinica (SPQ, MEQ e MQAE). --- espressione endogena di cromofori (GFP e YFP). --- l’indicatore raziometrico Clomeleon (CFP + TFP). Kuner et al., (2000). A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transient in cultured hippocampal neurons. Neuron 27,447-459.

Il Cl-sensor: un indicatore raziometrico e non invasivo Il Cl-sensor è una proteina di fusione costituita dalla CFP unita, tramite una regione linker di 20 amminoacidi, ad una forma mutata della YFP (YFP-H148Q/ I152L/V163S). VANTAGGI --- elevata sensibilità di legame al cloro (EC50 = 30 mM). Clomeleon (EC50 = 90 mM) ---Fluorecence ratio (R) = F445/F485 Markova O, Mukhtarov M, Real E, Jacob Y, Bregestovski P., (2008): Genetically encoded chloride indicator with improved sensitivity. Journal of Neuroscience Methods.; 170 : 67–76.

NELLE CELLULE SOTTOPOSTE AD UNO STRESS OSMOTICO, DOVUTO AD UNA SOLUZIONE IPOTONICA, SI OSSERVA L’ATTIVAZIONE DI UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA ISOTONICA IPOTONICA ISOTONICA 286 mOsm 205 mOsm 205 mOsm

UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTESTRETCH-ATTIVATA, AD ANDAMENTO RETTIFICANTE, NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 IPOTONICA

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE BV-2 VIENE INIBITA DALL’ ACIDO FLUFENAMICO

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E’ TRASPORTATA DALLO IONE CLORO X [Cl-]i = 0 mM [Cl-]e = 100 mM [Cl-]i = 144 mM

IL FLUSSO DEL CLORO NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL Cl-SENSOR --Proteina di fusione tra CFP e YFP*** --Indicatore raziometrico (R=F445/F485 ) Parametri importanti per vedere l’ingresso del cloro nelle cellule: 1) --- potenziale di riposo delle cellule BV-2 2) --- potenziale di equilibrio del cloro delle cellule BV-2 Il valore sperimentale del potenziale di riposo è stato misurato utilizzando la tecnica del patch-clamp nella configurazione di whole-cell, osservando il valore di potenziale a cui si registra una corrente netta uguale a zero. La media dei potenziali di riposo misurata è stata -40 ± 4 mV (n=27).

MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE Equazione di Nernst ECl = RT/zF ln [Cl-]i /[Cl-]e. Ecl = 58 log 10,3/150 = -67 mV

Cl- LA DEPOLARIZZAZIONE DELLE CELLULE BV-2, PERMETTE DI VEDERE UN FLUSSO DI CLORO INTRACELLULARE Allo scopo di ottenere un segnale di fluorescenza più chiaro del movimento del cloro, indotto dallo stimolo ipotonico, abbiamo utilizzato delle soluzioni extracellulari ad alta concentrazione di potassio (60 mM), per depolarizzare le cellule, aumentare la driving force che agisce sullo ione e vedere l’entrata del cloro. Vm= +21 mV?????? Che significa? [K+]i = 140 mM [K+]e = 4 mM [K+]e = 60 mM Cl-

NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO SI OSSERVA UN MOVIMENTO DI CLORO INTRACELLULARE

CONCLUSIONI Cl- Cl- Stiramento Le cellule BV-2 presentano una corrente attivata da stimoli ipotonici tipica della microglia: trasportata da ioni Cl- inibita dall’acido flufenamico, un bloccante dei canali anionici 2) In cellule che esprimono il sensore del Cl-, si osservano direttamente i flussi di Cl-.associati all’attivazione della corrente Cl- Stiramento Cl-sensor Distribuzione locale e dinamica del cloro Cl-