Le reazioni sierologiche Microbiologia, immunologia e laboratorio Fabio Fanti: da pag. 37 a 46 Reportage fotografico tratto da google immagini

Le reazioni sierologiche Che cosa sono? Le reazioni sierologiche Sono le reazioni antigene-anticorpo che avvengono in vitro.

Quando si eseguono? Si eseguono quando: Si vuole ricercare la presenza di anticorpi nel siero di un paziente per diagnosticare una malattia infettiva; Siero paziente (siero immune) + antigene corrispondente si vuole identificare un microrganismo in base agli antigeni che possiede. Sospensione microbica (antigeni) + antisiero (anticorpi)

Le reazioni sierologiche possono essere di diversi tipi: Quali possono essere le reazioni sierologiche? Le reazioni sierologiche possono essere di diversi tipi: Agglutinazione: quando l’antigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri); Precipitazione: quando l’antigene è solubile; Neutralizzazione:quando l’antigene, per azione del corrispondente anticorpo, perde la sua attività; Lisi: quando l’antigene è corpuscolato e la reazione avviene in presenza di complemento.

Alla base di ogni reazione sierologica c’è la formazione Che cosa si forma dall’unione di un antigene con il suo anticorpo? Alla base di ogni reazione sierologica c’è la formazione dell’ immunocomplesso Antigene + Anticorpo Immunocomplesso

Come si spiega la formazione degli immunocomplessi? Teoria del reticolo: è la teoria che spiega il processo di formazione degli immunocomplessi. A B C Il reticolo si forma solo quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale cioè si creano dei “ponti” tra un immunocomplesso e l’altro (B).

Passiamo in rassegna i vari tipi di reazione sierologica Agglutinazione diretta antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con siero contenente anticorpi specifici antigeni presenti sulla superficie delle cellule batteriche

Agglutinazione indiretta Antigeni o Anticorpi vengono fatti aderire artificialmente alla superficie di particelle corpuscolate come il lattice di polistirolo. Ricorda! La reazione di agglutinazione è molto sensibile anche a piccole quantità di anticorpi ed è molto usata per esempio per la TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA (tecnica di identificazione che fa uso di antisieri che reagiscono con i vari antigeni batterici permettendone il riconoscimento).

Agglutinazione I GRUPPI SANGUIGNI La reazione di agglutinazione, viene usata anche in EMATOLOGIA. I GRUPPI SANGUIGNI Nel 1901 il medico viennese Karl Landsteiner scoprì che sulla superficie dei globuli rossi dell'uomo sono presenti delle sostanze chiamate agglutinogeni (antigeni) e che nel plasma ci sono degli anticorpi chiamati agglutinine. Sulla base di queste scoperte il dottor Karl Landsteiner distinse nella specie umana tre gruppi sanguigni che vennero chiamati A, B, 0 (zero). Nel 1902 venne scoperto il quarto gruppo chiamato AB.

I gruppi sanguigni rappresentano quindi diversi tipi di sangue, distinti in base alla presenza o meno, sul globulo rosso, di antigeni e di agglutinine plasmatiche. Le agglutinine sono anticorpi capaci di distruggere in vitro e in vivo i globuli rossi contenenti antigeni di gruppo diverso, tramite una reazione di agglutinazione. . ATTENZIONE! Il ricevente non deve avere anticorpi rivolti contro i globuli rossi del donatore poichè se ciò si verificasse, la vita stessa del ricevente, potrebbe essere in pericolo.

IL FATTORE RH Nel 1941 Landsteiner e Wiener misero in evidenza nei globuli rossi di una scimmia, Macacus Rhesus, e successivamente in quelli umani, un nuovo antigene che chiamarono fattore Rh capace di determinare la comparsa di agglutinine specifiche nel sangue di altri individui. Un 'immunizzazione nei confronti di antigeni Rh può manifestarsi soltanto quale risultato di una trasfusione o di una gravidanza.

Determinazione dei gruppi sanguigni (antigeni presenti sulla superficie dei globuli rossi) Per eseguire il gruppo sanguigno basterà mettere a contatto una goccia di antisiero (contiene l’anticorpo) con una goccia di sangue (antigene) ed osservare in quale vetrino si osserva l’agglutinazione.

Come si può fare per rendere visibile l’agglutinazione in EMATOLOGIA? L’agglutinazione in ematologia è ben visibile quando: sono coinvolti gli anticorpi IgM (legano molte emazie ); E’ ben visibile anche quando si superano le cariche elettriche di superficie che tendono a far respingere le emazie, ciò è possibile utilizzando: soluzioni saline; enzimi; proteine come albumina; siero antiglobuline umane come il SIERO DI COOMBS.

Test di Coombs MEN Malattia Emolitica del Neonato Per ricercare gli anticorpi anti – Rh si deve eseguire il Test di Coombs. Può essere diretto: ricerca degli anticorpi sul sangue del neonato. Oppure indiretto: ricerca degli anticorpi nel siero della madre.

Test di Coombs Diretto Ricerca sul sangue del neonato + Anticorpi adesi alla superficie dei globuli rossi Siero di Coombs (siero antiglobuline umane) + = Agglutinazione

Test di Coombs Indiretto Ricerca degli anticorpi anti-Rh nel siero della madre Siero materno Formazione di immunocomplessi Siero di Coombs + Emazie Rh + + = Agglutinazione

Quale caratteristica ha l’antigene, in una reazione di precipitazione? Precipitazione antigene solubile (macromolecole o tossine) viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici. La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato. Per spiegarla si può fare questa prova Anche in questo caso il reticolo si forma solo quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale cioè si creano dei “ponti” tra un immunocomplesso e l’altro. Questa fase corrisponde al punto di equivalenza dove è massima la quantità di precipitato.

Esempi di reazione di precipitazione Immunodiffusione Si tratta di pozzetti scavati nell’agar. Quando si introducono antigene o anticorpo, essi diffondono e danno origine ad una banda di precipitazione nel punto d’incontro. Si esegue prima una elettroforesi delle proteine del siero su gel di agar stratificato su lastra di vetro. Ai lati, su dei solchi viene introdotto l’antisiero che contiene anticorpi contro le proteine del siero. All’unione tra proteine del siero separate e i rispettivi anticorpi, si formano degli archi caratteristici. Immunoelettroforesi

Western blot (immunofissazione) Altro modo per evidenziare la reazione antigene -anticorpo Western blot (immunofissazione) Usata per identificare gli anticorpi contro il virus dell’AIDS

Altro tipo di reazione antigene - anticorpo FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO E’ una tecnica utilizzata per la diagnosi di sifilide Siero in esame con anticorpi + antigene immunocomplesso + COMPLEMENTO di cavia + SISTEMA RIVELATORE formato da: Emolisine + Emazie Immunocomplesso Se il complemento è stato utilizzato dal 1^ immunocomplesso, non ci può essere emolisi, la reazione è positiva (presenza di anticorpi). Se invece si verifica emolisi, significa che il complemento si è reso disponibile per il sistema rivelatore, la reazione è negativa.

Immunoenzimatica E.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay I pozzetti possono contenere l’antigene oppure l’anticorpo come nel filmato.Facciamo l’esempio che il pozzetto contenga l’antigene. Si aggiunge il siero campione che contiene l’anticorpo. Si incuba e si procede al lavaggio per eliminare gli anticorpi che non si sono legati. A questo punto si aggiungono anticorpi anti-Ig marcati con un enzima. Questi si fissano agli anticorpi. Si procede al lavaggio e si aggiunge poi uno specifico substrato per l’enzima. Se compare una colorazione significa che la reazione è positiva. L’intensità del colore viene misurata allo spettrofotometro.

Altri modi per evidenziare la reazione antigene -anticorpo IMMUNOFLUORESCENZA Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti (fluorescina), sono molecole in grado di assorbire la luce ultravioletta emettendo poi radiazioni nel campo del visibile. Per poter osservare la reazione si utilizza un microscopio a fluorescenza. Diretta Diretta Siero Indiretta

Radioimmunologia R.I.A. Radio Immuno Assay L' isotopo è ciascuno degli atomi di uno stesso elemento, con lo stesso numero atomico ma con differente numero di massa. Possiedono lo stesso numero di protoni ed elettroni (quindi proprietà chimiche uguali) ma un diverso numero di neutroni (quindi proprietà fisiche diverse). Sono tecniche in cui la reazione antigene anticorpo è evidenziata da un isotopo radioattivo. La radioattività prodotta viene misurata con appositi strumenti. Questa tecnica si utilizza nella determinazione della concentrazione degli ormoni.