Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre 2004 VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA’ INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre 2004

ATTIVITA’ SVOLTA Determinazione della minima dose efficace, sulla permeabilità epiteliale di nuovi modulatori della via paracellulare Studio della cinetica d’azione sulla permeabilità intestinale, di molecole (es. delta-G, esapeptide) in grado di modulare la via paracellulare Verificare la cinetica del transito di macromolecole attraverso la mucosa intestinale resa permeabile dalle molecole sopra descritte.

Introduzione La permeabilità intestinale viene solitamente studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri. Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati dall’organismo. Il lattulosio è un disaccaride di PM 342.3 viene assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM 182.17 e viene assorbito per via transcellulare

Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al ramnosio Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn) Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLC

SCOPO DELLA RICERCA Semplificare lo studio della permeabilità intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio. Valutare l’azione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nell’assorbimento dei due zuccheri. Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50µl) e confronto con la metodica basata sulla raccolta urine. Per il dosaggio utilizzeremo sempre la metodica HPLC.

Caratteristiche strutturali della molecola delta-G utilizzata nel nostro modello sperimentale di permeabilità epiteliale

Determinazione della minima dose efficace di ΔG Preparazione della soluzione dei zuccheri con diverse concentrazioni di ΔG 120mg lact + 40mg Rh + 250ng ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 500µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 1µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 5µg ΔG in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 10µg ΔG in 200µl H2O

Prova su topi Prelievo di sangue (circa 100µl) a tempo 0 Somministrazione della soluzione di zuccheri senza e con + ΔG Prelievo successivo dopo 1h, Sierare il campione di sangue Deproteinizzare il siero Marcare il siero con FMOC-Idrazina Dosare gli zuccheri con HPLC

Confronto goccia di sangue con raccolta urine. raccolta urine a tempo zero somministrazione di soluzione degli zuccheri con Delta-G raccolta a 5h delle urine (utilizzando gabbia metabolica) filtrare il campione analisi con HPLC

Condizioni per il dosaggio degli zuccheri con HPLC Eluenti : A) ACN 25% - H2O 75% B) ACN 80% - H2O 20% Colonna : C18, lungh.10cm, Ø3µm, Vol. camp : 5µl flusso : 1ml/min Temp : ambiente Rilevatore : spettrofotometro (λ 270 nm)

Cromatogramma di campione di siero in assenza di ΔG rh lac

Cromatogramma di campione di siero in presenza di ΔG rh lac

Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri senza Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi 0.018 0.33 0.052 conigli siero 0.0033 0.137 0.026 conigli urine 0.0067 0.284 0.023

Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri con Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi 0.19 0.36 0.53 conigli siero 0.033 0.157 0.22 conigli urine 0.074 0.296 0.25

STUDIO DELLA CINETICA Prelievo di sangue a tempo zero Somnistrazione della soluzione dei zuccheri contenente 10µg di ΔG Prelievo successivo dopo 1h, 6h Somnistrazione della soluzione dei zuccheri senza ΔG Prelivo successivo dopo 7h, 9h, 11h

DIAGRAMMA DELLA CINETICA

RISULTATI Aumento della concentrazione di lattulosio in presenza di ΔG quindi: Evidente attività biologica da parte di ΔG sulle giunzioni serrate La sua attività biologica permane 6h dalla sua somministrazione per os

OBIETTIVI FUTURI Continuare lo studio della cinetica per un tempo prolungato (almeno fino 24 ore) Utilizzare queste molecole per permettere l’assorbimento di farmaci e peptidi attraverso la via paracellulare