3 Replicazione e Mantenimento del Genioma Biologia Molecolare Modulo B – Cap. 6, (7), (8) 8.3 Replic. semiconservativa Repliconi proc. ed euc. Sintesi semidiscontinua del DNA L’apparato di replicazione Trasposoni proc. e euc. Retrotrasposoni e retrovirus Il Gene - ediz.comp. Cap. 1 1.8 1.10 Cap. 15 15.1 15.6 Cap. 16 16.1 16.7 Cap. 17 17.1 17.2 Cap. 18 tutto Cap. 21 21.1 21.5 21.10 21.11 Cap. 22 22.1 22.5 22.7 22.12 Cap. 29 29.9

La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di: - DNA da replicare - precursori nucleotidi trifosfati (NTP) :

Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’ mai in direzione opposta 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’ mai in direzione opposta 3' HO P 5' 5' P OH P P P OH 3' HO P 5' 5' P OH 3' + PP

Da qui il problema della replicazione delle estremità 5’ Le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi di DNA su DNA a doppio o a singolo filamento ma sanno allungare una estremita 3’ di un complesso stampo/innesco Da qui il problema della replicazione delle estremità 5’

Come viene innescata la sintesi? In alcuni casi viene tagliato uno dei due filamenti del DNA per fornire una estremità 3’-OH alla DNA polimerasi

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante 5' 3'

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante

Replicazione del DNA del fago ΦX174 mediante il meccanismo del circolo rotante

Trasferimento del cromosoma di E.coli durante la coniugazione

Trasferimento del cromosoma di E. coli durante la coniugazione Durante la coniugazione, il fattore F o il cromosoma in cui esso è integrato, si replica mediante il meccanismo del “circolo rotante”. L’estremità 5’ conduce il singolo filamento dal donatore al ricevente.

Come viene innescata la sintesi? In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA

Come viene innescata la sintesi? In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA

Come viene innescata la sintesi? Nella maggiorparte dei casi l’innesco è costituito da piccoli tratti di RNA, chiamati inneschi (primer) RNA primer DNA

Replicazione di DNA circolari: l’ ansa D (nella replicazione del DNA mitocondriale)

Replicazione di DNA e ciclo cellulare in E.coli

Relazione tra replicazione e ciclo cellulare nei batteri

Poiché un ciclo replicativo può essere iniziato anche quando il ciclo precedente non è ancora terminato, un batterio può duplicarsi ogni 20 min anche se la replicazione dell’intero cromosoma richiede 40 min.

L’apparato enzimatico per la replicazione del DNA

Arthur Kornberg 1918 - 2007

La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di un complesso innesco/stampo

L’attivita’ delle DNA polimerasi 3' 5' 5'

Le tre DNA Polimerasi di E.coli monomero 100 kD si riparazione e completamento frammentii DNA pol II monomero 120 kD si no riparazione DNA pol III eteremulitimero (10 subunità) 900 kD si no replicazione STRUTTURA ATTIVITA ENZIM. allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’ RUOLO

La “correzione di bozze” HO P PPP OH HO P PPP OH * HO P OH HO P OH ?! HO P OH PPP HO P OH PPP

La “correzione di bozze”

Le DNA polimerasi hanno una struttura comune

Le DNA polimerasi hanno una struttura comune

La struttura della DNA polimerasi del fago T

Eventi che si susseguono alla forca di replicazione

Ambedue i filamenti parentali servono da stampo ma uno dei due si trova in direzione opposta a quella della sintesi

L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki

L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki FONDO CIMA 5’’ 10’’ 20’’

I due filamenti si replicano in maniera diversa, in modo che la sintesi avvenga sempre in direzione 5’ 3’ Filamento stampo parentale 3’ 5’ Filamento continuo (nuova sintesi) Direzione della replicazione DNA polimerasi 5’ 3’ Filamento ritardato (nuova sintesi) Frammento di Okazaki 3’ 5’ 5’ Filamento stampo parentale DNA replicato DNA non replicato

La DNA-ligasi

L’attivita’ della DNA ligasi P P P OH 3' 5' P A + P P G T C

La sintesi dei frammenti di Okazaki risolve il problema della direzione 5’ 3’ ... ... ma resta il problema che le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi ma solo allungare un innesco Questo viene risolto con la sintesi di brevi tratti di RNA (primer) da parte della primasi che sa iniziare la sintesi Direzione della replicazione DNA polimerasi Frammento di Okazaki 5’ 3’ Filamento stampo parentale Filamento continuo (nuova sintesi) Filamento ritardato (nuova sintesi) ’ inneschi (o primer) di RNA

La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche 3’ 5’ 5’ Innesco 3’ Frammento di Okazaki 3’ 5’ 5’ 5’ Ligasi Primasi DNA pol III DNA pol I

Pol III Primasi Pol I Ligasi La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche Pol III Primasi Pol I Ligasi Pol III

Le tre DNA Polimerasi di E.coli monomero 100 kD si riparazione e completamento frammentii DNA pol II monomero 120 kD si no riparazione DNA pol III eteremulitimero (10 subunità) 900 kD si no replicazione STRUTTURA ATTIVITA ENZIM. allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’ RUOLO

Replicazione continua della “leading strand” 3’ 5’ Origine della replicazione Replicazione bidirezionale Direzione della replicazione Replicazione continua della “leading strand” Replicazione discontinua della “lagging strand” con i frammenti di Okazaki