Le Biomolecole “utili” sono prodotte per: Sintesi Chimica Biosintesi (processi biotecnologici e reazioni enzimatiche Sintesi mista (enzimatico-chimica) Isolate da fonti naturali

Sintesi Chimica di molecole organiche La sintesi chimica di una molecola organica avviene per una o più reazioni tra varie molecole di reagenti e portano ad una variazione della struttura molecolare. Prima di iniziare una sintesi bisogna prendere in considerazione: Una buona progettazione della sequenza di reazioni da fare (è consigliabile una analisi retrosintetica) Il numero delle reazioni da fare La resa di ciascuna reazione e resa finale Le condizioni di reazione Le condizioni di purificazione (ogni fase o tutto alla fine) Il costo di tutto.

Semplice analisi retrosintetica. Per trasformazione di gruppi funzionali

Analisi retrosintetica con variazione nello scheletro carbonioso

A B Il numero delle reazioni da fare La resa di ciascuna reazione e resa finale E’ consigliabile adottare uno schema sintetico con un basso numero di reazioni. A patto che ciò non comporti un abbassamento della resa globale del prodotto finale La resa di un singolo stadio si calcola come il % in moli del reagente che si trasforma in prodotto 60% Vuol dire che solo il 60 % delle moli di A si trasformano in B A B

E A B C D Sintesi multistadio e resa globale 50% 50% 50% 50% Il prodotto E sarà ottenuto on una resa globale del (50 x 50 x 50 x 50) = 6.2 % Questo tipo di sintesi viene detta lineare

Sintesi multistadio convergente B 50% E D C 1.0 mol 12.5% 0.12 mol

La sintesi Chimica del Tassolo una sintesi con molti stadi J.Am.Chem.Soc. (1994) 116, 1597 and 1599

Sintesi in soluzione o sintesi in fase solida? La sintesi in soluzione prevede che i reagenti siano tutti solubilizzati in un opportuno solvente. I vantaggi: Reazioni veloci (dovuto alla elevata mobilità delle molecole) Reazioni stechiometriche Svantaggi: Il reagente in eccesso (se c’è rimane nella miscela di reazione) I sottoprodotti restano nella miscela di reazione insieme al prodotto desiderato. E’ necessaria una purificazione dopo ogni passaggio sintetico.

Sintesi in fase solida (schema generale)

La sintesi in fase solida prevede che un reagente sia legato ad un supporto solido (non solubile) I vantaggi: I sottoprodotti sono allontanati per semplice lavaggio e filtrazione del supporto solido che ha legato solo il prodotto di reazione desiderato. I reagenti in eccesso sono analogamente allontanati per lavaggio e filtrazione. Unica purificazione finale Svantaggi: Per ottenere rese alte è necessario usare forti eccessi del reagente in soluzione La scala di reazione spesso non è elevabile a piacere

Oggì è richiesta una sintesi chimica più veloce ed efficiente! Con l'avvento di nuovi è più veloci metodi di screening di attività che permettono la valutazione di decine e centinaia di prodotti in un solo giorno, lo stadio lento del processo di produzione di un farmaco è diventato la individuazione e la sintesi chimica dei prodotti da provare i quali, a loro volta, debbono essere il più possibile diversi tra loro, per poter facilitare la individuazione di nuove strutture attive. La sintesi chimica deve tenere il passo con le nuove potenzialità di screening biologico. Questo problema è stato risolto con la sintesi combinatoriale.

Sintetizzare un solo composto ? (strada lenta) o più composti simultaneamente (strada veloce) ed ottenere una miscela? Se il prodotto ricercato è stato progettato razionalmente allora bisogna sintetizzarlo con una struttura ben definita Se non si ha una idea esatta della struttura del composto, pensato essere farmacologicamente attivo, ma si ipotizza una struttura generica di una certa tipologia, allora può venire utile la Sintesi Combinatoriale

La sintesi Combinatoriale Questa tecnica sintetica produce un elevato numero di molecole che differiscono strutturalmente per piccole porzioni della molecola. Consente di sintetizzare un elevato numero di molecole da saggiare Così si ottengono vaste collezioni di prodotti (libraries, librerie) contenenti un alto numero di varianti di una struttura fondamentale;

A: sintesi organica classica. B:sintesi combinatoriale.

Esempio Numero di prodotti ottenibili in funzione della lunghezza del peptide utilizzando i 20 amminoacidi naturali.

La sintesi combinatoriale è applicabile anche a molecole piccole variando una parte della struttura Quanti possibili cicli imidazolici trisostituiti si ottengono? Derivati = 63 = 216

Tali librerie possono essere costituite da prodotti in soluzione o da prodotti ancorati ad una particella solida (bead, perlina). Sintesi in soluzione o Sintesi in fase solida Il metodo si presta molto bene ad essere automatizzato e sono già commercializzati dei sistemi robotizzati che sono in grado di produrre da 1000 a 2000 prodotti al giorno.

Come identificare il prodotto più attivo? A prima vista può sfuggire l'utilità di questa tecnica. Vi è chiaramente un risparmio di lavoro: se avevamo a disposizione 6 reagenti per posizione, abbiamo ottenuto 216 prodotti... peccato che siano tutti assieme! In realtà esistono tecniche di marcatura o deconvoluzione che permettono di risolvere elegantemente il problema dell'identificazione di un eventuale composto attivo tra i 1000 sintetizzati Le procedure di deconvoluzione permettono di identificare i composti di interesse attraverso un processo interattivo di screening e sintesi.

Libreria su sferette (di vetro) identificazione mediante saggio con recettore fluorescente “On-Bead Assay for Receptor Binding using a Fluorescently Labeled Receptor” Solo le sferette che hanno legato la molecola attiva che riconosce il recettore divengono fluorescenti Libreria di molti prodotti. Su ogni sferetta c’è legata una sola tipologia di molecola.

Un possibile metodo di selezione per affinità con il recettore Micro sferetta colorabile A: il recettore è mescolato con le perline della libreria. B: il recettore si lega alla perlina che contiene il prodotto affine. C: si aggiunge il substrato dell'enzima; la perlina, alla quale è legato il recettore modificato, si colora (porpora) e può essere individuata ed isolata.

Il metodi di sintesi è definito: Vediamo un esempio concreto di sintesi in fase solida di una libreria di 27 prodotti e come si individua il prodotto più biologicamente attivo Il metodi di sintesi è definito: Sintesi parcellizata (Split Sinthesis) In genere la sintesi in fase solida viene effettuata su un supporto solido facilmente parcellizzabile o rimescolabile. Sono preferite sferette di vetro o altro materiale, comunque di forma definita e dimesioni non troppo piccole in quanto devono, in alcuni casi, poi poter essere anche individuate singolarmente

Split synthesis (mixture libraries)

Split synthesis (continuazione)

Perchè non è conveniente fare così? Perchè la reattività dei prodotti può non essere la stessa e ciò porta ad una libreria in cui I prodotti non sono egualmente rappresentati. Nella Split synthesis tutti i composti sono in eguali quantità pechè ogni accoppiamento è individualmente controllato (ovvero con un solo reagente)

Deconvolution della libreria attraverso attività biologica e sintesi di sub-librerie (Selezione del composto attivo) Si staccano i prodotti dal supporto e si ottengono tre librerie ognuna contenente nove prodotti di tipo X-Y-Z. La Libreria che termina con il residuo H risulta la più attiva.

Tra i nove prodotti selezionati ‘c’è il prodotto attivo Tra i nove prodotti selezionati ‘c’è il prodotto attivo. Per individuarlo bisogna suddividere il gruppo in tre sottogruppi che si possono sintetizzare a partire dai dimeri separati. I tre sottogruppi, staccati dal supporto sono poi saggiati per l’attività biologica. Il Diagramma indica che il prodotto che termina per D-H è quello più attivo. Ciò restringe il campo a soli tre possibili prodotti: A-D-H, B-D-H, C-D-H

Si sintetizzano singolarmente i tre prodotti, si staccano dai supporti e si saggiano. Risultato: il prodotto C-D-H è il più attivo!

Problemi: • La deconvoluzione può essere un lavoro lungo •Il lavoro può essere falsato dalla bassa concentrazione del prodotto attivo • L’attività, a volte, può dipendere dalla combinazione di più prodotti. Ciò impedisce l’idenficazione del singolo composto attivo Vantaggio: • Può essere sinntetizzato un elevato numero di composti in un tempo breve (dipende dalla sintesi)

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile” Questa tipologia di sintesi si basa su molecole legate ad un supporto in genere una superficie su cui si fa passare il reagente solo in determinate zone (come in caselle di una scacchiera). Ogni zona (casella) avrà un determinato prodotto.

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile” Il recettore (“labelled”) si fa passare su tutta la superficie della scacchiera individuando la zona e quindi la molecola che lo lega specificamente

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile” Invece di supporti stratificati in un foglio oggi si preferisce usare apparati automatici che consentono più sintesi contemporanee in fase solida. Ogni supporto è collocato in un reattore separato su cui vengono fatti passare i diversi reagenti. Il risultato è lo stesso (ma con maggiori quantità ottenibili) di una sintesi spazialmente indirizzable su diverse zone di superficie

Apparato automatico per sintesi di libreria (simultanea su più reattori diversi) Acc. Chem. Res. 1996, 29, 114-122

Un blocco precostituito di 100 mini reattori per libreria di 100 composti

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile” Vantaggi: Si sintetizzano composti puri (non in miscela) quindi non c’è bisogno di deconvoluzione Svantaggi: Le librerie tendono ad essere piuttosto piccole

Esempio di sintesi divergente