per la crescita e la duplicazione cellulare, così come per far avvenire tutte le reazione del metabolismo, è necessaria la disponibilità di nutrienti si definiscono nutrienti le sostanze utilizzate per le biosintesi e la produzione di energia

esigenze nutrizionali dei microrganismi meccanismi di assunzione dei nutrienti metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio

MACROELEMENTI: necessari in elevate quantità esigenze nutrizionali dei microrganismi meccanismi di assunzione dei nutrienti metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio MACROELEMENTI: necessari in elevate quantità il 95% del peso secco (senza H2O) di una cellula è costituito da carbonio ossigeno idrogeno azoto zolfo fosforo potassio calcio magnesio ferro carboidrati, lipidi, proteine, acidi nucleici macroelementi cofattori di enzimi

Sono componenti essenziali per la vita di una cellula ? gli elementi necessari in quantitativi ridotti (presenti in tracce) si dicono micronutrienti e sono: manganese zinco cobalto molibdeno nickel rame nei siti attivi di molti enzimi o cofattori enzimatici Sono componenti essenziali per la vita di una cellula ?

microrganismi classificati in gruppi nutrizionali AUTOTROFI sono organismi che utilizzano l'anidride carbonica (CO2) come fonte di carbonio ETEROTROFI sono organismi che utilizzano come fonte di carbonio molecole organiche ridotte Fonte di carbonio FOTOTROFI sono organismi che utilizzano la luce solare come fonte di energia CHEMIOTROFI sono organismi che utilizzano l'ossidazione di composti chimici organici o inorganici come fonte di energia Fonte di energia LITOTROFI sono organismi che utilizzano l'ossidazione di composti chimici inorganici come fonte di elettroni ORGANOTROFI sono organismi che utilizzano l'ossidazione di composti chimici organici come fonte di elettroni

azoto proteine / acidi nucleici / lipidi mentre i MICROELEMENTI necessari alla crescita cellulare vengono acquisiti come impurità di altri composti, i MACROELEMENTI che entrano a far parte di molecole organiche devono essere acquisiti dalla cellula specificamente carbonio ossigeno idrogeno azoto zolfo fosforo molecola organica, H2O azoto proteine / acidi nucleici / lipidi zolfo proteine / cofattori / vitamine fosforo acidi nucleici / fosfolipidi / cofattori Tutte le molecole organiche essenziali per la vita della cellula (componenti cellulari o loro precursori) che l'organismo è incapace di sintetizzare autonomamente si dicono FATTORI DI CRESCITA e sono principalmente AMINOACIDI, BASI AZOTATE o VITAMINE

esigenze nutrizionali dei microrganismi meccanismi di assunzione dei nutrienti metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio Trasporto passivo: avviene secondo il gradiente di concentrazione e non richiede un consumo di energia Trasporto attivo: avviene contro il gradiente di concentrazione e richiede consumo di energia. Trasporto passivo diffusione passiva diffusione facilitata (CO2, H2O, O2) (mediata da un carrier) (glicerolo)

Figura 4. 1 Diffusione passiva e diffusione facilitata Figura 4.1 Diffusione passiva e diffusione facilitata. Dipendenza del tasso di diffusione dal gradiente di concentrazione del soluto (il rapporto tra concentrazione extra- e intracellulare). Si noti l’effetto di saturazione – evidenziato dal plateau nel grafico – che si verifica al di sopra di uno specifico valore del gradiente, nel caso di diffusione facilitata da una proteina carrier. L’effetto di saturazione si osserva ogni volta che nel trasporto è coinvolto un carrier.

Figura 4. 2 Modello della diffusione facilitata Figura 4.2 Modello della diffusione facilitata. La proteina di membrana con funzione di carrier può cambiare conformazione in seguito al legame con una molecola di soluto esterna, che poi viene rilasciata all’interno della cellula. Successivamente la proteina riacquista la forma originale, orientata verso l’esterno, ed è pronta a legare un’altra molecola di soluto. Poiché il tutto avviene senza apporti di energia, il soluto continuerà a penetrare soltanto finché la concentrazione esterna resterà superiore a quella interna.

Trasporto attivo: contro gradiente Trasporto attivo: contro gradiente. L'energia richiesta per trasportare una molecola è tanto maggiore quanto maggiore è la differenza di concentrazione di quella molecola ai due lati della membrana citoplasmatica

trasporto simultaneo di due sostanze in direzioni opposte (es trasporto simultaneo di due sostanze in direzioni opposte (es. Na+ all’esterno e H+ all’interno) trasporto simultaneo di due sostanze nella stessa direzione (es. lattosio + protone)

Figura 4.5 La traslocazione di gruppo: il trasporto mediato dal PTS batterico. Il sistema fosfotransferasico fosfoenolpiruvato: zucchero (PTS) di E. coli e di S. typhimurium. Il sistema è formato dalle seguenti componenti: il fosfoenolpiruvato, PEP; l’enzima I, EI; la proteina termostabile a basso peso molecolare, HPr; e l’enzima Il, EIl. Il fosfato ad alta energia viene trasferito da HPr a EIIA, una componente solubile dell’enzima EII. EIIA è unito a EIIB nel sistema per il trasporto del mannitolo, mentre è separato da EIIB nel sistema del glucosio. Durante il trasporto attraverso la membrana, il fosfato viene trasferito da EIIA a EIIB quindi allo zucchero, in entrambi i sistemi. Sono possibili anche altre forme di relazione tra le componenti di EII. Per esempio, IIA e IIB possono formare una proteina solubile separata dal complesso della membrana; anche in questo caso il fosfato passa da IIA a IIB e poi al dominio (o ai domini) di membrana.

Trasporto e assunzione del ferro ferro essenziale perchè presente nella struttura dei citocromi e di molti ezimi ione ferrico (Fe3+) poco solubile e quindi poco disponibile per il trasporto secrezione di SIDEROFORI (formano complessi con Fe3+ Figura 4.6 I complessi sideroforo-ione ferrico. (a) Il ferricromo è una molecola di idrossamato ciclico [—CO—N(O−)—] prodotta da molti funghi. (b) E. coli produce l’enterobactina, un catecolato ciclico. (c) Lo ione ferrico probabilmente si complessa con tre siderofori a formare un complesso esacoordinato ottaedrico; qui è illustrato il complesso ferro-enterobactina.

esigenze nutrizionali dei microrganismi meccanismi di assunzione dei nutrienti metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio Terreni sintetici (definiti): a composizione chimica definita; contengono il minimo indispensabile per consentire la crescita di una particolare specie batterica Terreni complessi: a composizione chimica non definita; contengono estratti di altre cellule (lievito) o di tessuti animali (Brain-Heart Infusion Broth) o di piante (tryptic soy broth) Terreni solidi: terreni liquidi sintetici o complessi + 1-2% di agar AGAR: polisaccaride estratto dalle alghe che gelifica a temperature inferiori ai 40°C. Non tossico, non metabolizzabile dai microrganismi

uso dei terreni solidi Terreni selettivi: terreni arricchiti con particolari composti per favorire la crescita di specifici microrganismi o per sfavorire la crescita di altri Terreni differenziali: terreni che permettono di differenziare alcune specie batteriche da altre mettendo in evidenza particolari caratteristiche metaboliche - secrezione di proteasi: terreno contenente albumina (opaco). alone chiaro intorno alla colonia che degrada l’albumina - attività emolitica: (agar-sangue) isolamento colture pure (striscio su piastra) osservazione morfologia delle colonie (caratteristica di ogni specie) conta batterica (conta vitale)

Figura 4. 7 Tecnica della piastra per diffusione Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1) Deporre con una pipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2) Immergere un’apposita bacchetta di vetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarla raffreddare. (4) Distribuire uniformemente, strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante la bacchetta sterile. Incubare.

isolamento batteri da colture miste

Figura 4. 9 Tecnica della piastra per inclusione Figura 4.9 Tecnica della piastra per inclusione. Il campione originale è sottoposto a diluizioni seriali, in modo da ridurre in misura sufficiente il numero delle cellule microbiche presenti. I campioni con la diluizione più alta vengono poimescolati con agar caldo, quindi la miscela viene versata in piastre di petri. Le cellule isolate crescono formando colonie e possono essere usate per costituire colonie pure. Le colonie in superficie sono circolari, quelle al di sotto della superficie in genere hanno forma lenticolare.