esigenze nutrizionali dei microrganismi meccanismi di assunzione dei nutrienti metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio Terreni sintetici (definiti): a composizione chimica definita; contengono il minimo indispensabile per consentire la crescita di una particolare specie batterica Terreni complessi: a composizione chimica non definita; contengono estratti di altre cellule (lievito) o di tessuti animali (Brain-Heart Infusion Broth) o di piante (tryptic soy broth) Terreni solidi: terreni liquidi sintetici o complessi + 1-2% di agar AGAR: polisaccaride estratto dalle alghe che gelifica a temperature inferiori ai 40°C. Non tossico, non metabolizzabile dai microrganismi

uso dei terreni solidi Terreni selettivi: terreni arricchiti con particolari composti per favorire la crescita di specifici microrganismi o per sfavorire la crescita di altri Terreni differenziali: terreni che permettono di differenziare alcune specie batteriche da altre mettendo in evidenza particolari caratteristiche metaboliche - secrezione di proteasi: terreno contenente albumina (opaco). alone chiaro intorno alla colonia che degrada l’albumina - attività emolitica: (agar-sangue) isolamento colture pure (striscio su piastra) osservazione morfologia delle colonie (caratteristica di ogni specie) conta batterica (conta vitale)

Figura 4. 7 Tecnica della piastra per diffusione Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1) Deporre con una pipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2) Immergere un’apposita bacchetta di vetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarla raffreddare. (4) Distribuire uniformemente, strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante la bacchetta sterile. Incubare.

isolamento batteri da colture miste

Figura 4. 9 Tecnica della piastra per inclusione Figura 4.9 Tecnica della piastra per inclusione. Il campione originale è sottoposto a diluizioni seriali, in modo da ridurre in misura sufficiente il numero delle cellule microbiche presenti. I campioni con la diluizione più alta vengono poimescolati con agar caldo, quindi la miscela viene versata in piastre di petri. Le cellule isolate crescono formando colonie e possono essere usate per costituire colonie pure. Le colonie in superficie sono circolari, quelle al di sotto della superficie in genere hanno forma lenticolare.

crescita batterica

Crescita batterica scissione binaria

Crescita batterica gemmazione

Crescita batterica esponenziale: 1 cellula 2 cell. 4 cell. 8 cell. 16 cell. No = numero di cellule nella popolazione iniziale Nt = numero di cellule al tempo t n = numero di generazioni (numero di divisioni cellulari) Nt = No x 2n

Batteri filamentosi (es. Streptomyces) (crescita apicale)

FASE DI LATENZA Fase di adattamento alle condizioni di crescita (temperatura, terreno di coltura) N° di cellule costante nel tempo Durata variabile

FASE ESPONENZIALE (o LOGARITMICA) fase di duplicazione cellulare in cui la velocità di crescita è costante e dipendente dalle condizioni di crescita N° di cellule aumenta nel tempo e tutte le cellule impiegano lo stesso tempo per duplicarsi (TEMPO DI GENERAZIONE = tempo impiegato da una cellula per duplicarsi)) tempo di generazione è variabile e dipendente dalla specie batterica e/o condizioni di crescita)

FASE STAZIONARIA Interruzione della crescita, N° di cellule costante nel tempo (densità della popolazione batterica max 109 per ml) equlibrio tra divisione cellulare e morte accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti

FASE DI MORTE diminuzione del numero di cellule vive nel tempo andamento in molti casi logaritmico (ogni ora muore una percentuale costante di cellule) accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti

No = numero di cellule nella popolazione iniziale Crescita batterica: in fase esponenziale ogni microrganismo si duplica a intervalli di tempo costanti, quindi la popolazione raddoppia nell’arco di un certo tempo detto TEMPO DI GENERAZIONE: N° cellule: 1 2 4 8 16 32......... 20 21 22 23 24 25 No = numero di cellule nella popolazione iniziale Nt = numero di cellule al tempo t n = numero di generazioni (numero di divisioni cellulari) Nt = No x 2n (aumento di tipo esponenziale o logaritmico) log Nt = log No + nlog2 n = log Nt - log No = log Nt - log No log2 0,301

g = 1 k velocità di crescita = N° di generazioni nell’unità di tempo k = n / t k = log Nt - log No 0,301 t tempo di generazione (g) = tempo occorrente per una duplicazione cellulare Nt = 2 No in una generazione t = g k = log (2 No) - log No = log2 + log No - log No 0,301 g 0,301 g g = 1 k k = 0,301 + log No - log No = 1 0,301 g g

una popolazione batterica aumenta da 103 a 109 cellule in 10 ore. calcolare la velocità di crescita (k) e il tempo di generazione (g) e graficamente: il tempo di generazione è l’intervallo di tempo necessario per avere una duplicazione cellulare

misura della crescita batterica misura della concentrazione cellulare (conta del numero di cellule) misura della massa cellulare

conta batterica totale

conta batterica vitale

conta batterica vitale

misura della massa cellulare: valutazione delle torbidità Figura 5.8 Torbidità e misurazione della massa microbica. Determinazione della massa microbica tramite misurazione dell’assorbimento della luce. Al crescere della popolazione, e quindi della torbidità, aumenta la dispersione della luce per cui aumentano i valori dell’assorbanza forniti dallo spettrofotometro. L’apparecchio ha due scale: quella inferiore mostra i valori dell’assorbanza; quella superiore, la percentuale di trasmittanza. L’assorbanza aumenta al diminuire della percentuale di trasmittanza. la trasmittanza T diminuisce all’aumentare del numero di cellule Lo spettrofotometro misura la densità ottica (OD= -logT) direttamente proporzionale alla massa cellulare

misura della massa cellulare: misura del peso secco cellule centrifugate per eliminare il sopranatante asciugate in una stufa pesate

coltura continua le cellule sono mantenute costantemente in fase esponenziale

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni microrganismi osmotolleranti: sintesi o assunzione di soluti compatibili (colina, betaina, prolina, ac. glutammico) la presenza di soluti influenza anche la disponibilità di acqua la disponibilità di acqua viene espressa come attività dell'acqua (valore max=1) aw = Psol / Pacqua dove Psol è la pressione di vapore della soluzione e Pacqua è la pressione di vapore dell'acqua pura la presenza di soluti fa diminuire l’attività dell’acqua

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni gli osmotolleranti mantengono una concentrazione elevata di soluti nel citoplasma per trattenere l’acqua (sintesi di soluti compatibili) alofili estremi (Halobacterium) isolato nel mar Nero richiede concentrazioni saline vicine alla saturazione (elevato K+ intracellulare) essiccazione, aggiunta di sale, come metodo per la conservazione degli alimenti

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni acidofili, neutrofili basofili pH citoplasmatico mantenuto neutro

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni influenza la velocità delle reazioni

psicrofili: enzimi efficienti a basse T membrane con acidi grassi insaturi = + fluide a bassa T termofili: enzimi termostabili membrane con acidi grassi saturi = aumenta il punto di fusione archea: legami eterei e monostrato

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni tollerano basse concentrazioni di O2 muoiono in presenza di O2 non necessitano di O2 necessitano di O2 ignorano O2

+ - O2 + e- O2-* ione superossido O2-* + e- H2O2 perossido di idrogeno anaerobi aerobi + - aerotolleranti 2O2-* + 2H+ O2 + H2O2 superossido dismutasi 2 H2O2 2H2O + O2 catalasi 2 H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+ perossidasi

2 H2O2 2H2O + O2 acqua ossigenata produzione di O2 per attività della catalasi

Figura 5. 17 Il sistema anaerobio GasPak Figura 5.17 Il sistema anaerobio GasPak. La busta GasPak libera idrogeno e anidride carbonica. Il catalizzatore al palladio nel coperchio della camera catalizza la formazione di acqua a partire da idrogeno e ossigeno, favorendo la rimozione dell'ossigeno dalla camera sigillata ermeticamente.

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni specie batteriche barotolleranti e barofile

Fattori che influenzano la crescita microbica: disponibilità di acqua concentrazione di soluti pH temperatura concentrazione di ossigeno pressione radiazioni raggi X e raggi , causano rottura doppi legami e legami idrogeno, danni al DNA Deinococcus radiodurans endospore batteriche raggi UV

crescita batterica in sistemi aperti (in ambiente naturale) batteri non coltivabili (90-99 % dei batteri presenti in un habitat naturale)

Controllo dei microrganismi mediante agenti fisici e chimici Sterilizzazione: eliminazione di tutte le cellule microbiche e di tutti i virus da un determinato habitat Disinfezione: eliminazione dei soli microrganismi patogeni Sanificazione: riduzione della popolazione microbica a livelli considerati sicuri

Figura 6. 1 Morte di una popolazione microbica Figura 6.1 Morte di una popolazione microbica. Il grafico del numero di cellule sopravvissute rispetto ai minuti di esposizione a una temperatura di 121 °C rivela un andamento esponenziale. In questo esempio il valore D121 è di 1 minuto.

Fattori che influenzano l'efficacia di un agente antimicrobico: dimensioni della popolazione composizione della popolazione concentrazione dell'agente antimicrobico durata dell'esposizione temperatura condizioni ambientali locali maggiore è la dimensione della popolazione e maggiore sarà il tempo necessario all'agente antimicrobico per svolgere la sua azione

Metodi di controllo fisici: calore filtrazione radiazioni

Metodi di controllo fisici: calore filtrazione radiazioni calore secco calore umido MISURA DELL’EFFICACIA DEL TRATTAMENTO: TDP (thermal death point): la più bassa temperatura capace di uccidere una sospensione microbica in 10 minuti TDT (thermal death time): il minor tempo necessario ad uccidere tutti i microrganismi di una sospensione ad una data temperatura ed in condizioni ambientali definite

Tempo di riduzione decimale (valore D): il tempo necessario per uccidere il 90% dei mirorganismi ad una certa temperatura (o per ridurre il numero dei microrganismi vivi presenti in un campione di 10 volte (di un ordine di grandezza su scala logaritmica) Figura 6.1 Morte di una popolazione microbica. Il grafico del numero di cellule sopravvissute rispetto ai minuti di esposizione a una temperatura di 121 °C rivela un andamento esponenziale. In questo esempio il valore D121 è di 1 minuto. T = 121°C D121= 1 min Il valore D varia con la T e si usa per stimare la resistenza di un microrganismo alla temperatura calcolando il valore z

Il valore z: è l'aumento di temperatura necessario per ridurre il valore D di 10 volte (di un ordine di grandezza su scala logaritmica) aumentando la T diminuisce D (cioè il tempo necessario per uccidere il 90% dei batteri) L’aumento di T necessario per diminuire D di 10 volte rappresenta il valore Z (121°C D=1 min) 100 min (a 100,5°C) 10 min ( a 111°C) Z=10,5 cioè un aumento di T di 10,5 °C permette di ridurre il tempo di esposizione (D) di 10 volte(ottenendo la morte del 90% dei batteri)

nel caso di Clostridium botulinum il trattamento termico deve essere tale da ridurre una popolazione di 1012 spore a 1 Il valore D per queste spore a 121°C è 0,204 minuti, quindi serviranno 12D = 2,5 a 121°C per ridurre il numero di spore da 1012 a 1 il valore z per le spore di Clostridium botulinum è 10°C (cioè una variazione di 10°C provoca una variazione di 10 volte del valore D) quindi se il trattamento termico viene fatto a 111°C e non a 121°C il tempo necessario per ridurre il numero di spore da 1012 a 1 sarà 10 volte maggiore cioè 2,04 minuti e quindi il valore 12D sarà 25 minuti

AUTOCLAVE (sterilizzazione a calore umido)

Metodi di controllo fisici: calore filtrazione radiazioni pastorizzazione: 63°C 30 min pastorizzazione HTST (HighTemperatureShortTime): 72°C 15 sec UHT (UltraHighTemperature): 150°C 2-3-sec basse temperature

Metodi di controllo fisici: calore filtrazione radiazioni filtri con pori da 0,2 e 0,1 m per sostanze termolabili

Metodi di controllo fisici: calore filtrazione radiazioni raggi UV per sterilizzare gli ambienti raggi  per alcuni alimenti

Agenti di controllo chimici: fenolo e derivati alcooli alogeni metalli pesanti composti quaternari dell'azoto aldeidi sterilizzanti gassosi

Agenti di controllo chimici: fenolo e derivati alcooli alogeni metalli pesanti composti quaternari dell'azoto aldeidi sterilizzanti gassosi

Agenti di controllo chimici: fenolo e derivati alcooli alogeni metalli pesanti composti quaternari dell'azoto aldeidi sterilizzanti gassosi

Agenti di controllo chimici: fenolo e derivati alcooli alogeni metalli pesanti composti quaternari dell'azoto aldeidi sterilizzanti gassosi fluoro, cloro, bromo, iodio Cl2 + H2O HCl + HClO acido ipocloroso Ca(OCl)2+2H2O Ca(OH) 2 + HClO acido ipocloroso HClO HCl + O

Agenti di controllo chimici: fenolo e derivati alcooli alogeni metalli pesanti (argento, arsenico, mercurio,....) composti quaternari dell'azoto (detergenti) aldeidi sterilizzanti gassosi

In 1 litro di coltura batterica contenente 1 In 1 litro di coltura batterica contenente 1.00x103 cellule la velocità di crescita è 2 (tempo in ore). Calcolare: a) il numero di cellule per millilitro dopo 6 generazioni esponeneziali; b) il tempo di generazione; c) il tempo impiegato per effettuare le 6 generazioni esponenziali. Nt = No x 2n = 1x103 x 26 = 103 x 64 = 64x103 = 64,000 cellule totali 64 cellule per millilitro b) g = 1/k = 1/2 = 0,5 ore = 30 minuti c) t = g x n = 30 x 6 = 180 minuti = 3 ore

Coltiviamo in un litro di terreno di crescita 2x103 cellule di un ceppo batterico prelevate da una coltura stazionaria. Il ceppo in esame ha le seguenti proprietà Fase di latenza: 30 minuti. Velocità di crescita (unità di tempo in ore):1 Calcolare: a) il numero di cellule totale dopo 4 generazioni esponenziali b) il tempo di generazione c) il tempo totale impiegato per raggiungere il numero finale di cellule Nt = No x 2n = 2x103x24 = 2x103x16 = 32x103 = 32,000 cellule totali b) g = 1/k = 1/1 = 1 ora = 60 minuti t = (g x n) + latenza = (60 minuti x 4) + 30 min = 240 minuti + 30 minuti = = 270 min = 4,5 ore

In 100 millilitri di terreno di crescita il numero iniziale di cellule presenti è 2,00x103. Dopo 5 ore il numero di cellule è 1,28x105. Calcolare: a) il numero di generazioni necessarie per raggiungere il numero finale di cellule b) la velocità di crescita n = log Nt - log No = (5+log1,28) - (3+log2)= (5+0,1) - (3+0,3) =5,1-3,3 =1,8 = 6 0,301 0,301 0,301 0,301 0,301 2.000 4.000 8.000 16.000 32.000 64.000 128.000 k = n/t = 6/5 = 1,25(con il tempo espresso in ore) = 0,02(con il tempo espresso in minuti)

Indicate in che struttura cellulare ed in che tipo di organismi si trova la seguente molecola Indicate come può essere definito un terreno di crescita che contiene in un litro di acqua distillata: 10 g di estratto di lievito 10 g di glucosio 5 g di estratto di fegato 3 g di K2HPO4 5 g di KH2PO4 200 mg di MgSO4 minimo a composizione chimica definita; massimo a composizione chimica indefinita

................. Indicate quale dei seguenti metodi di conta batterica è adatto per determinare il numero di batteri vivi presenti in un campione: A) misura spettrofotometrica; B) conta su piastra; C) conta diretta al microscopio; D) determinazione del peso umido; E) determinazione del peso secco. Nel metabolismo ........................ la fonte di energia é un composto chimico inorganico che si .............................. cedendo elettroni ad un accettore finale degli elettroni. Indicate se la frase seguente é corretta o sbagliata ; in questo secondo caso sottolineate la parte o le parti eventualmente sbagliate: Le lipoproteine sono un costituente della parete cellulare dei Gram negativi. In particolare sono associati alla faccia interna della membrana esterna e servono a collegare la membrana esterna con la sottostante membrana citopasmatica Indicate quali delle seguenti definizioni sono correttamente riferite ai batteri Gram-positivi, quali ai Gram-negativi e quali ad entrambi: Gram-positivi Gram-negativi ................... .................. hanno una membrana esterna ................... .................. sono impermeabili alla colorazione di Gram ................... .................. contengono acidi teicoici ................... ................. contengono peptidoglicano ................... ................ nei fosfolipi della membrana ci sono legami estere