SENSORI & BIOSENSORI: Analisi dei Prodotti Gianfranco Greppi Laboratorio di Bionanotecnologie. Porto Conte Ricerche Università di Sassari

Sommario Ricerca e Trasferimento Perché i biosensori La tecnolgia Le applicazioni

infrastrutture di base Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione Università Enti pubblici e Non-profit building block building block Imprese con i propri laboratori infrastrutture di base 3

INVESTIMENTI IN CONOSCENZA RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA’ +0,8 4

Un percorso per il trasferimento tecnologico nel settore delle Biotecnologie Relatore: GIANFRANCO GREPPI- LEA BIOTECH SPINOFF UNIMI 5

infrastrutture di base Il sistema della ricerca, della sperimentazione e del trasferimento dell’innovazione Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione Università Enti pubblici e Non-profit building block building block Imprese con i propri laboratori infrastrutture di base 6

Ogni istituzione può giocare molteplici ruoli: formazione, ricerca fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico - i legami tra gli attori del sistema si sono intensificati: le collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze - la comparsa e l'affermazione del sistema finanziario come nuovo attore nei SI, con un ruolo del Venture Capital -Start-up nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e nei Centri di Eccellenza scientifica. 7

INVESTIMENTI IN CONOSCENZA RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA’ +0,8 8

TRASFERIMENTO DIDATTICA APPLICATA RICERCA DI BASE SPIN-OFF APPLICATA 9

RECESSIONE E MANCATA RICERCA SPIN-OFF APPLICATA RICERCA DI BASE DIDATTICA 10

BIOTECH & PMI (2003) Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro. 11

BIOTECH & PMI (2003) 12

BIOTECH & PMI 1990 vs 2010 Vecchi valori Nuovi valori BASSI COSTI HIGH THROUGHPUT QUALITA’ DEI DATI INTEGRAZIONE STANDARDIZZAZIONE DECENTRALIZZAZIONE INFORMAZIONE Vecchi valori Nuovi valori CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA 13

BIOTECH & PMI 2006-2010 SCREENING NUOVI LEAD PROTEOMICA GENOMICA ARRAY MICRO DIMENSIONI INFORMAZIONE DIGITALE NUOVE PIATTAFORME BASSI CONSUMI REAGENTI MISURE DIRETTE 14

BIOTECH & PMI TREND 15

BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E PER LA BIOSICUREZZA DEI PRODOTTI 16

BIOTECH & PMI TREND 17

BIOTECH & PMI PRODOTTI 18

PIATTAFORMA BIOTECH RICERCA SVILUPPO ANALISI CHIMICA ANALISI BIOLOGICA GENOMICA SVILUPPO RICERCA ANALISI CHIMICA ANALISI BIOLOGICA IDENTIFICA IL TARGET VALIDA IL TARGET IDENTIFICA IL LEAD OTTIMIZZA LEAD TEST PRE-CLINICI CLINICI PROTEOMICA FARMACOGENOMICA DRUG DELIVERY Bioinformatica

Biotech & Fusion Technologies Genomics, Proteomics and Bioinformatics: Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beads Combinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular Breeding High throughput analysis: Nucleic Acid based Sequencing Microarrays Protein based. 2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS, SELDI Imaging/optical biology. Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology). Bioinformatica 20

MICROARRAY 21

PROTEOMICA 22

le cose a quelli che fanno cose La conoscenza deve scorrere da quelli che sanno le cose a quelli che fanno cose Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002 23

Perchè i biosensori? I biosensori sono degli strumenti analitici con potenzialità enormi, sia in termini di interesse scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali: Capo medico diagnostico. Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività bioterrorismo. Analisi dei patogeni negli alimenti Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici negli alimenti

I biosensori I BIOSENSORI sono degli strumenti analitici costituiti da un componente biologico e un trasduttore. trasduttore comp. biologico film protettivo PC

Schema logico di un sensore Unità di elaborazione Unità di memorizzazione Interfaccia elettronica

Perchè i biosensori? Analisi degli alimenti Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque Analisi dei patogeni Analisi diossine Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici

Cosa misura il biosensore? L’attività dell’enzima:

I trasduttori Trasduttori usati per la costruzione di biosensori:

Trasduttori ottici Un biosensore a trasduttore ottico misura i cambio di assorbanza di uno strato di reagente biologico che interagisce con l’analita.

Risonanza di superficie a plasmon SPR

Trasduttori acustici

Trasduttori potenziometrici pHmetro: Glucosio ossidasi glucose + O2  gluconolactone + H2O2  gluconate + H+ Lipasi lipide neutro + H2O  glicerolo + acidi grassi + H+

Trasduttori potenziometrici ISE al NH4+: L-amino ossidasi L-amino acido + O2 + H2O  keto acido + NH4+ + H2O2 asparaginasi L-asparagine + H2O  L-aspartate + NH4+

Trasduttori potenziometrici ISE al I-: perossidasi H2O2 + 2H+ + 2I-  I2 + 2H2O ISE al CN-: glucosidasi amigdalina + 2H2O  2glucose + benzaldeide + H+ + CN-

Trasduttori conduttimetrici Enzima Lamina d’oro o di platino Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità della soluzione in prossimità degli elettrodi.

Trasduttori amperometrici L’amperometria misura una corrente ad un potenziale applicato costante. Add 10mM steady-state Add 10mM steady-state Current background Time

Amperometria

Corrente e potenziale Su un metallo inerte, applico un potenziale anodico, o catodico, relativamente ad un elettrodo di riferimento. Il metallo misura una corrente anodica o catodica, in base al numero delle specie in soluzione che si possono ossidare o ridurre.

Potenziale anodico e catodico +++++ --------- Potenziale anodico: La superficie è povera di elettroni. Una specie chimica capace di donare elettroni verrà ossidata Potenziale catodico: La superficie è ricca di elettroni. Una specie chimica capace di ricevere elettroni verrà ridotta

Biosensori amperometrici Working electrode H2O2 Substrato ox elettroni Substrato red O2

Biosensori amperometrici Si classificano in I, II e III generazione

Biosensori della I generazione La prima classe di biosensori amperometrici riguarda la misura diretta del prodotto della reazione enzimatica: Perossido di idrogeno NADH Consumo del cofattore (ossigeno)

Biosensori della I generazione Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso si basava sulla misura dell’ossigeno consumato durante la reazione enzimatica di un ossidasi, tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV, seguendo la reazione: Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50 mM e 1 mM.

Biosensori della I generazione Un’alternativa al primo biosensore si basa: sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla superficie dell’elettrodo sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione:

Biosensori della I generazione Il perossido di idrogeno può anche venire ridotto all’elettrodo di platino, secondo la seguente equazione:

Biosensori della I generazione Alternativamente, è possibile misurare la produzione di NADH da NAD+ quando si usano enzimi tipo deidrogenasi: Il NADH è ossidato all’elettrodo, ma sono richiesti potenziali molto alti.

Biosensori II generazione I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore naturale dell’enzima con una molecola capace di traghettare gli elettroni dal centro attivo dell’enzima alla superficie del trasduttore amperometrico. Working electrode Mediatore red Substrato ox elettroni Substrato red Mediatore ox

Cos’è un mediatore? I mediatori si possono classificare in: Molecole organiche Complessi organici di metalli di transizione Molecole inorganiche Polimeri conduttori Idealmente, il mediatore dovrebbe essere piccolo da entrare facilmente nel sito attivo dell’enzima, essere riciclabile, scambiare elettroni velocemente con l’elettrodo.

Cos’è un mediatore?

Cos’è un mediatore? Per un processo reversibile:

Biosensori II generazione Ulteriori sviluppi nell’utilizzo dei biosensori della II generazione riguardano l’impiego di polimeri conduttori: Polipirrolo Polianilina Politiofene Questi polimeri hanno la capicità di formare film conduttivi, che possono essere impiegati per immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo.

Biosensori II generazione polianilina polipirrolo politiofene Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori.

Biosensori III generazione

Componenti bioattivi

Biotecnologia Applicata: Analisi dei Prodotti Vegetali Lezione 7

no enzyme present enzyme present energy Intermediate : enzyme/reactant 1 + reactant 2 reactant 1 + reactant 2 + enzyme products + enzyme Course of reaction Replay Close window

Fattori che influenzano l’attività

Tecniche di immobilizzazione