Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) Il file PDB Il file PDB http://www.rcsb.org/pdb Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 […] fisica24ore

coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido X Y Z … ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O … fisica24ore

1a3n catena A C O N S EME Fe fisica24ore

RASMOL v 2.7 http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm fisica24ore

Tecniche computazionali L’utilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo computazionale è l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi biologici. Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in relazione alla sua attività. fisica24ore

Limiti delle tecniche sperimentali risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione fisica24ore

Limiti delle tecniche computazionali Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato periodo di tempo (102-104 picosecondi) può essere simulato  piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo fisica24ore

importanza della COMPLEMENTARITA’ DELL’APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE fisica24ore

Scala dei tempi e delle distanze per una proteina 0.01 - 5 Å 10-15 - 10-1 s  Movimenti locali: fluttuazioni atomiche movimenti delle catene laterali movimenti dei loops   1 - 10 Å 10-9 - 1 s  Movimenti di corpo rigido: movimento delle eliche movimento dei domini (piegamento degli hinge loops) movimento delle subunità > 5 Å 10-7 - 104 s  Movimenti su larga scala: transizioni elica - coil dissociazione/associazione folding e unfolding fisica24ore

Alcune Applicazioni In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica. fisica24ore

Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili. fisica24ore

Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione. fisica24ore

Studiare le variazioni conformazionali provocate dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla). fisica24ore

Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva. fisica24ore

Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione. fisica24ore

Modellizzazione molecolare fisica24ore

Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina fisica24ore

Diagramma di flusso della modellizzazione proteica Sequenza proteica Dati sperimentali Allineamento multiplo di sequenza Ricerca nelle banchedati Assegnazione dei domini Proteina omologa nella banca dati PDB? Predizione della struttura secondaria Predizione del fold No Analisi della famiglia del fold E’ stato predetto un fold? Sì Sì Allineamento delle strutture secondarie Modellizzazione comparativa Allineamento della sequenza alla struttura No Predizione della struttura terziaria Modello tridimensionale della proteina fisica24ore

Modellizzazione comparativa (o per similarità di sequenza) Permette di costruire la struttura tridimensionale di una proteina sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con un’altra proteina di struttura NOTA che viene usata come STAMPO. fisica24ore

1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e “stampo” Passi fondamentali 1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e “stampo” * aa identici . aa simili fisica24ore

2. Costruzione dello scheletro fisica24ore

3. Inserimento delle catene laterali fisica24ore

4. Inserimento dei loop corrispondenti a “buchi” nell’allineamento fisica24ore

5. Ottimizzazione del modello Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni Eliminazioni di clash strutturali Minimizzazione energetica fisica24ore

6. Controllo della qualità del modello fisica24ore

Meccanica molecolare Meccanica molecolare Comprende la DINAMICA MOLECOLARE, la RICERCA DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE, e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING). fisica24ore

Asssunzioni fondamentali Nucleo ed elettroni sono «ammassati» in una sola particella atomo-simile. Tali particelle atomo-simili sono sferiche e possiedono una carica. Le interazioni sono basate sui potenziali delle molle e sui potenziali classici. Le interazioni devono essere pre-attribuite a specifici set di atomi. Le interazioni determinano la DISTRIBUZIONE SPAZIALE delle particelle atomo-simili e la loro ENERGIA. fisica24ore

Ad ogni conformazione molecolare è associata un’ENERGIA fisica24ore

La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle. La forma più semplice dell’energia potenziale di una molecola è : ENERGIA pot = Energia di ALLUNGAMENTO dei legami + Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame + Energia di TORSIONE degli angoli diedri + Energia delle interazioni di NON-LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche Forma equazione + parametri = force field fisica24ore

Forma matematica più comune: |-Energia di allungamento-| |------------------Energia di piegamento--------------------| |-------------Energia torsionale-----------| |-----------------Energia di non-legame------------------| fisica24ore

Ricerca dell’energia conformazionale Ricerca dell'energia conformazionale di una molecola Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina fisica24ore

La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo assoluto)  fisica24ore

Conformazione energeticamente preferita minimo globale dell'energia potenziale risultante delle forze nulla equilibrio stato più popolato fisica24ore

Minimizzazione dell’energia Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile. fisica24ore

Strategie di ricerca del minimo globale Campionamento energetico sistematico: L’energia viene campionata ad intervalli regolari sull’intera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami). fisica24ore

Annealing simulato: riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento. fisica24ore

Ricerca casuale: campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate Dinamica molecolare: superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale. fisica24ore

Dinamica molecolare Dinamica molecolare Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio: stabilità delle proteine variazioni conformazionali folding proteico trasporto ionico fisica24ore

Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola. fisica24ore

per tutti gli atomi del sistema molecolare La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell’ equazione del moto di Newton Fi = mi  ai per tutti gli atomi del sistema molecolare Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale: Fi = - dV/dri si combinano le due equazioni e si ottiene: - dV/dri = mi d2ri/dt2 che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni di posizione in funzione del tempo ed è quella che viene integrata. fisica24ore

Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno: delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate atomiche) delle velocità iniziali delle accelerazioni 1. le posizioni inziali ri si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling; 2. le velocità iniziali vi si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura; 3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale. fisica24ore

Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli altri tempi t. In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti Dt. Dt tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari  una simulazione di 100 ps coinvolge 105-106 intervalli di integrazione. fisica24ore

Sistema allo zero assoluto Riscaldamento lento alla temperatura di simulazione Riequilibrazione dell’energia tra gli atomi Temperatura di simulazione desiderata Energia cinetica totale del sistema Distribuzione iniziale di velocità vi fisica24ore

Protocollo di simulazione Struttura iniziale rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali Minimizzazione dell’ energia nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole d’acqua Solvatazione della proteina Minimizzazione dell’ energia in presenza del solvente per equilibrarlo con la struttura si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura  nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata. Fase di riscaldamento la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia Fase di equilibrazione Fase di simulazione vera e propria fisica24ore

Analisi dei risultati Analisi dei risultati Campionamento periodico di coordinate (e velocità) Calcolo dell’energia potenziale media in funzione del tempo Calcolo della differenza con la struttura di partenza in funzione del tempo Calcolo della superficie accessibile al solvente e del raggio di girazione, in funzione del tempo Calcolo della struttura media fisica24ore

Riconoscimento molecolare E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch) fisica24ore

La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici. fisica24ore

scoperta di composti guida nuovi e innovativi Sviluppo di farmaci Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività fisica24ore

tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco Ricerca del composto guida (1-2 anni) Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni) Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni) Test tossicologici (1-3 anni) Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno) Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni) Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni Costo totale: circa $ 500 000 000 è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità fisica24ore

Ricerca di nuovi composti guida Screening sperimentale: test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore Metodi computazionali detti Rational Design: si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando fisica24ore

Metodi computazionali Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota Structure Based Drug Design QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship) Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore. De Novo Design I nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici. Screening Virtuale Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame Docking fisica24ore

Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando. Docking Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando. Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore. Tali funzioni valutano: Complementarità fra superficie Energia libera di solvatazione Interazioni elettrostatiche e idrofobiche fisica24ore

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In conclusione... Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per: la modellazione di sistemi proteici la comprensione dei processi biologici la comprensione della relazione struttura-attività la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali fisica24ore