Biofisica fisica24ore Il file PDB HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) […]

Biofisica fisica24ore REMARK 900 RELATED ENTRIES REMARK 900 THIS ENTRY IS RELATED TO PDB ENTRY 1A3O. REMARK 999 REMARK 999 SEQUENCE REMARK 999 1A3N B SWS P NOT IN ATOMS LIST REMARK 999 1A3N D SWS P NOT IN ATOMS LIST DBREF 1A3N A SWS P01922 HBA_HUMAN DBREF 1A3N B SWS P02023 HBB_HUMAN DBREF 1A3N C SWS P01922 HBA_HUMAN DBREF 1A3N D SWS P02023 HBB_HUMAN SEQRES 1 A 141 VAL LEU SER PRO ALA ASP LYS THR ASN VAL LYS ALA ALA SEQRES 2 A 141 TRP GLY LYS VAL GLY ALA HIS ALA GLY GLU TYR GLY ALA SEQRES 3 A 141 GLU ALA LEU GLU ARG MET PHE LEU SER PHE PRO THR THR SEQRES 4 A 141 LYS THR TYR PHE PRO HIS PHE ASP LEU SER HIS GLY SER SEQRES 5 A 141 ALA GLN VAL LYS GLY HIS GLY LYS LYS VAL ALA ASP ALA SEQRES 6 A 141 LEU THR ASN ALA VAL ALA HIS VAL ASP ASP MET PRO ASN SEQRES 7 A 141 ALA LEU SER ALA LEU SER ASP LEU HIS ALA HIS LYS LEU SEQRES 8 A 141 ARG VAL ASP PRO VAL ASN PHE LYS LEU LEU SER HIS CYS SEQRES 9 A 141 LEU LEU VAL THR LEU ALA ALA HIS LEU PRO ALA GLU PHE SEQRES 10 A 141 THR PRO ALA VAL HIS ALA SER LEU ASP LYS PHE LEU ALA SEQRES 11 A 141 SER VAL SER THR VAL LEU THR SER LYS TYR ARG […]

Biofisica fisica24ore HET HEM A HET HEM B HET HEM C HET HEM D HETNAM HEM PROTOPORPHYRIN IX CONTAINING FE HETSYN HEM HEME FORMUL 5 HEM 4(C34 H32 N4 O4 FE1) FORMUL 6 HOH *455(H2 O1) HELIX 1 1 PRO A 4 SER A HELIX 2 2 PRO A 37 TYR A HELIX 3 3 ALA A 53 ALA A HELIX 4 4 MET A 76 ALA A HELIX 5 5 SER A 81 HIS A HELIX 6 6 PRO A 95 HIS A HELIX 7 7 PRO A 119 THR A HELIX 8 8 PRO B 5 LYS B HELIX 9 9 VAL B 20 VAL B HELIX PRO B 36 PHE B HELIX PRO B 51 GLY B HELIX PRO B 58 HIS B HELIX LEU B 81 ASP B HELIX PRO B 100 GLU B HELIX PRO B 124 ALA B HELIX PRO C 4 SER C HELIX PRO C 37 TYR C HELIX ALA C 53 ALA C HELIX VAL C 73 ALA C HELIX SER C 81 HIS C HELIX PRO C 95 HIS C HELIX PRO C 119 THR C HELIX PRO D 5 LYS D HELIX VAL D 20 VAL D HELIX PRO D 36 PHE D HELIX GLU D 43 PHE D HELIX PRO D 51 GLY D HELIX PRO D 58 ALA D HELIX LEU D 78 ASP D HELIX PRO D 100 GLU D HELIX PRO D 124 ALA D LINK FE HEM A 142 NE2 HIS A 87 LINK FE HEM B 147 NE2 HIS B 92 LINK FE HEM C 142 NE2 HIS C 87 LINK FE HEM D 147 NE2 HIS D 92

Biofisica fisica24ore ATOM 1 N VAL A N ATOM 2 CA VAL A C ATOM 3 C VAL A C ATOM 4 O VAL A O ATOM 5 CB VAL A C ATOM 6 CG1 VAL A C ATOM 7 CG2 VAL A C ATOM 8 N LEU A N ATOM 9 CA LEU A C ATOM 10 C LEU A C ATOM 11 O LEU A O ATOM 12 CB LEU A C ATOM 13 CG LEU A C ATOM 14 CD1 LEU A C ATOM 15 CD2 LEU A C ATOM 16 N SER A N ATOM 17 CA SER A C ATOM 18 C SER A C ATOM 19 O SER A O ATOM 20 CB SER A C ATOM 21 OG SER A O … XYZ coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido

Biofisica fisica24ore 1a3n catena A C O N S EME Fe

Biofisica fisica24ore RASMOL v 2.7

Biofisica fisica24ore Tecniche computazionali Lutilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo computazionale è lapproccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi biologici. Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in relazione alla sua attività.

Biofisica fisica24ore Limiti delle tecniche sperimentali risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione

Biofisica fisica24ore Limiti delle tecniche computazionali Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<N A ) atomi o di gradi di libertà (di solito atomi), per un limitato periodo di tempo ( picosecondi) può essere simulato piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi

Biofisica fisica24ore importanza della COMPLEMENTARITA DELLAPPROCCIO TEORICO- SPERIMENTALE

Biofisica fisica24ore Scala dei tempi e delle distanze per una proteina Å s Movimenti locali: fluttuazioni atomiche movimenti delle catene laterali movimenti dei loops Å s Movimenti di corpo rigido: movimento delle eliche movimento dei domini (piegamento degli hinge loops) movimento delle subunità > 5 Å s Movimenti su larga scala: transizioni elica - coil dissociazione/associazione folding e unfolding

Biofisica fisica24ore Alcune Applicazioni In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica.

Biofisica fisica24ore Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.

Biofisica fisica24ore Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.

Biofisica fisica24ore Studiare le variazioni conformazionali provocate dallinterazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce lattivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

Biofisica fisica24ore Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.

Biofisica fisica24ore Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita unindicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio dazione.

Biofisica fisica24ore Modellizzazione molecolare

Biofisica fisica24ore Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

Biofisica fisica24ore Sequenze casuali non sono in grado di ripiegarsi in maniera univoca Esse sono una piccola famiglia di sequenze selezionate dalla natura attraverso levoluzione. Ciascuna ha un minimo globale distinto, ben separato dagli altri stati metastabili. Quali sono le proprietà uniche e comuni a tutti gli elementi di questo particolare insieme di sequenze di tipo proteico? Le proteine presenti in natura non sono sequenze casuali.

Biofisica fisica24ore Diagramma di flusso della modellizzazione proteica Sequenza proteica Proteina omologa nella banca dati PDB? Predizione della struttura secondaria Allineamento delle strutture secondarie Predizione della struttura terziaria Modellizzazione comparativa Dati sperimentali Assegnazione dei domini Allineamento multiplo di sequenza Predizione del fold E stato predetto un fold? Analisi della famiglia del fold Ricerca nelle banchedati No Sì No Allineamento della sequenza alla struttura Modello tridimensionale della proteina

Biofisica fisica24ore che viene usata come STAMPO. Permette di costruire la struttura tridimensionale di una proteina sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con unaltra proteina di struttura NOTA

Biofisica fisica24ore Utilizza strutture note (template) di uno o più membri di una famiglia strutturale-funzionale per predire la struttura (target) di un altro membro della famiglia la cui sequenza sia nota. Si basa sulle seguenti osservazioni: le proteine appartengono ad un numero limitato di famiglie strutturali proteine della stessa famiglia hanno strutture tridimensionali molto simili

Biofisica fisica24ore 1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e stampo Passi fondamentali * aa identici. aa simili

Biofisica fisica24ore 2. Costruzione dello scheletro

Biofisica fisica24ore 3. Inserimento delle catene laterali catene

Biofisica fisica24ore 4. Inserimento dei loop corrispondenti a buchi nellallineamento loop

Biofisica fisica24ore 5. Ottimizzazione del modello Minimizzazione energetica Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni Eliminazioni di clash strutturali

Biofisica fisica24ore 6. Controllo della qualità del modello

Biofisica fisica24ore Meccanica molecolare e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING). Comprende la DINAMICA MOLECOLARE, la RICERCA DELLENERGIA CONFORMAZIONALE,

Biofisica fisica24ore Nucleo ed elettroni sono «ammassati» in una sola particella atomo-simile. Tali particelle atomo-simili sono sferiche e possiedono una carica. Le interazioni sono basate sui potenziali delle molle e sui potenziali classici. Le interazioni devono essere pre-attribuite a specifici set di atomi. Le interazioni determinano la DISTRIBUZIONE SPAZIALE delle particelle atomo-simili e la loro ENERGIA. Asssunzioni fondamentali

Biofisica fisica24ore Ad ogni conformazione molecolare è associata unENERGIA

Biofisica fisica24ore La forma più semplice dellenergia potenziale di una molecola è : ENERGIA pot = La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle. Forma equazione + parametri = force field Energia di ALLUNGAMENTO dei legami + Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame + Energia di TORSIONE degli angoli diedri + Energia delle interazioni di NON- LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche bending stretching torsion

Biofisica fisica24ore Forma matematica più comune: |-Energia di allungamento-|| Energia di piegamento | | Energia torsionale || Energia di non-legame |

Biofisica fisica24ore Ricerca dellenergia conformazionale Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio) Linformazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa Lo stato nativo è il minimo assoluto dellenergia libera della proteina

Biofisica fisica24ore La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo assoluto)

Biofisica fisica24ore Conformazione energeticamente preferita minimo globale dell'energia potenzialeequilibriostato più popolatorisultante delle forze nulla

Biofisica fisica24ore Campionamento energetico sistematico : Lenergia viene campionata ad intervalli regolari sullintera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).

Biofisica fisica24ore Annealing simulato: riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento.

Biofisica fisica24ore Dinamica molecolare (poco): superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale. Ricerca casuale: campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate

Biofisica fisica24ore Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile. Minimizzazione dellenergia

Biofisica fisica24ore Dinamica molecolare Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio: stabilità delle proteine variazioni conformazionali folding proteico trasporto ionico

Biofisica fisica24ore Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola.

Biofisica fisica24ore La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell equazione del moto di Newton F i = m i a i per tutti gli atomi del sistema molecolare Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale rispetto alle posizioni atomiche: F i = - dV/dr i si combinano le due equazioni e si ottiene: - dV/dr i = m i d 2 r i /dt 2 che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni della posizione dellatomo i-esimo in funzione del tempo, ed è quella che viene integrata.

Biofisica fisica24ore 3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale. Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno: 1.delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate atomiche) 2.delle velocità iniziali 3.delle accelerazioni 1. le posizioni inziali r i si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling; 2. le velocità iniziali v i si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura;

Biofisica fisica24ore In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti t. t tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari una simulazione di 100 ps coinvolge intervalli di integrazione. Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli altri tempi t.

Biofisica fisica24ore Sistema allo zero assoluto Temperatura di simulazione desiderata Riscaldamento lento alla temperatura di simulazioneRiequilibrazione dellenergia tra gli atomiDistribuzione iniziale di velocità v i Energia cinetica totale del sistema

Biofisica fisica24ore Struttura iniziale rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole dacqua per equilibrarlo con la struttura la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia Fase di simulazione vera e propria Minimizzazione dell energia Solvatazione della proteina Minimizzazione dell energia in presenza del solvente Fase di riscaldamento Fase di equilibrazione si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.

Biofisica fisica24ore Analisi dei risultati Campionamento periodico di coordinate (e velocità) Calcolo dellenergia potenziale media in funzione del tempo Calcolo della differenza con la struttura di partenza in funzione del tempo Calcolo della superficie accessibile al solvente e del raggio di girazione, in funzione del tempo Calcolo della struttura media

Biofisica fisica24ore Riconoscimento molecolare E il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)

Biofisica fisica24ore La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante allinterno dei processi biologici.

Biofisica fisica24ore La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es. idrofobiche). Gli atomi del sito di legame forniscono limpalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato contorno e particolari proprietà chimiche Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

Biofisica fisica24ore Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando. Insieme di tecniche che consentono di simulare interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una nuova molecola di inibitore) e di valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano. docking

Biofisica fisica24ore In questultimo caso, viene trovato il corretto modo di legame di un composto tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano lenergia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore. Tali funzioni valutano fattori quali: Complementarità fra superficie Energia libera di solvatazione Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

Biofisica fisica24ore AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, GRID… Algoritmi di docking. Posizionano ligandi - rigidi o flessibili - in siti di binding proteici generalmente rigidi. algoritmi Prendendo in considerazione anche la flessibilità del recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche migliaia di gradi di libertà. Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa assunzione segue il modello chiave-serratura citato in precedenza.

Biofisica fisica24ore Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività farmaci

Biofisica fisica24ore 1.Ricerca del composto guida (1-2 anni) 2.Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni) 3.Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni) 4.Test tossicologici (1-3 anni) 5.Test per la sicurezza sulluomo (1 anno) 6.Test per lefficacia sulluomo (1-2 anni) tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco è di grande importanza lidentificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni Costo totale: circa $

Biofisica fisica24ore Screening sperimentale: test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore Metodi computazionali detti Rational Design: si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando

Biofisica fisica24ore Metodi computazionali Struttura 3D del recettore NON notaStruttura 3D del recettore nota Structure Based Drug Design QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship) Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e lattività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dallanalisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore. De Novo Design I nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici. Screening Virtuale Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame Docking

Biofisica fisica24ore

Biofisica fisica24ore

Biofisica fisica24ore Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per: la modellazione di sistemi proteici la comprensione dei processi biologici la comprensione della relazione struttura-attività la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali