Tecniche di preparazione e conservazione degli emocomponenti Bologna, 11/3/2006 Franco Verlicchi - Centro Trasfusionale Faenza/Lugo – AUSL Ravenna

Definizioni prodotti del sangue gli emocomponenti e gli emoderivati i prodotti ricavati dal frazionamento del sangue con mezzi fisici semplici o con aferesi emoderivati i farmaci plasmaderivati ovvero le specialità medicinali estratte dall’emocomponente plasma mediante processo di lavorazione industriale Legge 21/10/2005, n° 219: Nuova disciplina delle attività trasfusionali e della produzione nazionale degli emoderivati

Terapia trasfusionale mirata emocomponenti i prodotti ricavati dal frazionamento del sangue con mezzi fisici semplici o con aferesi Sangue intero Eritrociti Leucociti Piastrine Plasma Emocomponenti di 2° livello Terapia trasfusionale mirata Conservazione idonea di ciascun componente

Emocomponenti non ottenibili da unità di sangue intero Centrifugazione + filtrazione Eritrociti Leucociti Piastrine Plasma Quantità raccolta Emocomponenti non ottenibili da unità di sangue intero

Eritrociti Leucociti Plasma Plasma Piastrine Piastrine Leucociti Centrifugazione Piastrine Piastrine 2000 rpm 5-8 min Centrifugazione 3500 rpm 15-20 min Leucociti Eritrociti Plasma Leucociti Centrifugazione Piastrine Piastrine

Eritrociti Emazie concentrate Emazie concentrate private del buffy coat Emazie concentrate con aggiunta di soluzioni additive Emazie concentrate private del buffy-coat e risospese in soluzioni additive Emazie lavate Emazie leucodeplete Emazie irradiate Emazie congelate Concentrato di emazie da aferesi

Emazie concentrate 2-6 °C 35 gg Emazie concentrate private del buffy-coat

Emazie concentrate con aggiunta di soluzioni additive 2-6 °C 42 gg Emazie concentrate private del buffy-coat e risospese in soluzioni additive

Conservare il minor tempo possibile (<24 h se apertura del sistema) Emazie lavate PNH – deficit IgA Lavaggi con soluzione isotonica a 4 °C Proteine < 0.3 g/unità 2-6 °C Conservare il minor tempo possibile (<24 h se apertura del sistema)

Emazie leucodeplete Emazie irradiate 25-50 Gy Filtrazione - Leucociti < 1x106 25-50 Gy 2-6 °C Stessa durata del prodotto corrispondente (<24 h se apertura del sistema) Irradiazione entro 14 gg dal prelievo Trasfusione entro 28 gg dal prelievo Trasfusione entro 48 ore dall’irradiazione in neonati o iperpotassemia

Emazie leucodeplete Riduzione alloimmunizzazione Riduzione infezioni post-operatorie Riduzione reazioni trasfusionali non-emolitiche Riduzione GVHD Riduzione trasmissione patogeni (CMV, CJD) Riduzione mortalità post-operatoria (cardio-chirurgia) Riduzione ospedalizzazione

Utilizzare nel più breve tempo possibile Emazie congelate Glicerolo 40% Glicerolo 15-20% Entro 7 gg dalla raccolta -60 -80 °C Azoto liquido (-150 °C) Fino a 10 anni Scongelamento Deglicerolizzazione Utilizzare nel più breve tempo possibile

Leucociti Concentrato granulocitario da aferesi Cellule staminali emopoietiche periferiche

Concentrato granulocitario da aferesi Authors’ conclusions: ‘Currently there is inconclusive evidence from RCTs to support or refute the generalized use of granulocyte transfusion therapy in the most common neutropenic patient population’

Concentrato granulocitario da aferesi Mobilizzazione leucocitaria nel donatore (Steroidi o G-CSF) Conservazione a 20-24°C per 24 h Utilizzare nel più breve tempo possibile Granulociti da sangue intero (buffy-coat): Utilizzati, prevalentemente in OE pediatrica, negli anni ‘80 Abbandonati per inefficacia

Cellule staminali emopoietiche periferiche Da aferesi Uso autologo o omologo Preparazione del paziente/donatore (mobilizzazione CD34) Ciclofosfamide 4 g /m2 (autologo) G-CSF s.c. per 4-5 gg 1-2 procedure (2-3 ore) in giorni successivi Congelamento in azoto liquido con crioprotettori Conservazione a -80°C Scongelamento a 37°C e impiego immediato

Cellule staminali emopoietiche periferiche Da cordone ombelicale Facilità di prelievo Necessità meno stringente di HLA-matching Ridotta GVHD Minore rischio di rigetto (blando condizionamento) Ridotto numero di cellule CD34 (pazienti pediatrici) Espansione in vitro Congelamento in azoto liquido con crioprotettori Conservazione a -80°C Scongelamento a 37°C e impiego immediato

Piastrine Concentrato piastrinico da aferesi Concentrato piastrinico da plasma-piastrinoaferesi Concentrato piastrinico da singola unità di sangue intero Concentrato piastrinico da pool di buffy-coat Concentrato piastrinico lavato Concentrato piastrinico irradiato Piastrine crioconservate (da aferesi) Gel piastrinico

Concentrato piastrinico da singola unità di sangue intero Plasma Centrifugazione Plasma 2000 rpm 5-8 min Piastrine Sangue intero (20-24 °C) Centrifugazione Leucociti 3500 rpm 15-20 min Piastrine Centrifugazione Concentrato piastrinico da pool di buffy-coat Leucociti

Fino a 5 gg dal prelievo 20-24 °C Agitazione continua

Come concentrati piastrinici Eritrociti Leucociti Piastrine Plasma Concentrato piastrinico lavato Concentrato piastrinico irradiato Come concentrati piastrinici Piastrine crioconservate (da aferesi) Congelamento entro 24 ore dal prelievo Crioprotettore (DMSO) Conservazione 1 anno a -80°C, 10 anni a -150°C Utilizzo immediato dopo scongelamento Gel piastrinico

Concentrato piastrinico da singola unità di sangue intero Plasma Centrifugazione Plasma 2000 rpm 5-8 min Piastrine Sangue intero (20-24 °C) Centrifugazione Leucociti 3500 rpm 15-20 min Piastrine Centrifugazione Concentrato piastrinico da pool di buffy-coat Leucociti

Utilizzare nel più breve tempo possibile Gel piastrinico Concentrato piastrinico da singola unità di sangue intero Autologo Quantità di sangue intero variabile (30-50 cc) Aggiunta di calcio e trombina Elevato contenuto di fattori di crescita degli α-granuli Favorisce i processi di riparazione tessutale Utilizzato in chirurgia maxillo-faciale, ortopedia, trattamento ulcere cutanee Utilizzare nel più breve tempo possibile

Plasma Plasma fresco congelato Crioprecipitato Plasma privo di crioprecipitato Colla di fibrina PLASMADERIVATI Albumina e soluzioni di proteine plasmatiche Immunoglobuline Uso ev Specifiche anti-HBV Specifiche anti-tetano Fattori della coagulazione

Plasma fresco congelato Separato entro 6 ore (non oltre 18) dal prelievo Congelamento a -30° completato entro 1 ora Congelato entro 6 ore dal prelievo Tipo A (aferesi) Tipo B (scomposizione) Congelato tra 6 e 72 ore dal prelievo Tipo C (scomposizione) Albumina Immunoglobuline ATIII FVIII FIX Complesso protrombinico

Plasma fresco congelato Utilizzo per uso clinico entro 24 mesi se conservato ad almeno -25°C 3 mesi se conservato tra -18°C e -25°C Scongelato a 30-37°C con idonea strumentazione Utilizzato nel più breve tempo possibile Entro 24 ore se conservato a 0-4°C

Plasma fresco congelato Scongelamento a 1-6°C Crioprecipitato FVIII, FXIII, vWF, fibrinogeno, fibronectina Plasma privo di crioprecipitato (cryosupernatant) vWF metalloproteasi (ADAMTS13) Ricongelamento entro 1 ora 24 mesi se conservato ad almeno -25°C 3 mesi se conservato tra -18°C e -25°C Utilizzato nel più breve tempo possibile Entro 24 ore se conservato a 0-4°C

Crioprecipitato (autologo) Calcio + trombina Colla di fibrina Crioprecipitato (autologo) Calcio + trombina Facilitazione della cicatrizzazione delle ferite chirurgiche Azione favorevole sull’emostasi Utilizzato nel più breve tempo possibile Congelamento 24 mesi se conservato ad almeno -25°C 3 mesi se conservato tra -18°C e -25°C Crioprecipitato Piastrine congelate Calcio + trombina Gel criopiastrinico

Emoderivati (Plasmaderivati) Albumina e soluzioni di proteine plasmatiche Immunoglobuline Uso ev Specifiche anti-HBV Specifiche anti-tetano Fattori della coagulazione Metodiche di precipitazione/purificazione Metodi fisici (crioprecipitazione) Metodi fisico-chimici (etanolo - Cohn) Metodiche cromatografiche Gel-filtrazione Cromatografia a scambio ionico e interazione idrofobica Cromatografia ad affinità

Emoderivati (Plasmaderivati) – Riduzione rischio infettivo Quarantena donazione esami Fase finestra Pathogen inactivation technology

Pathogen inactivation Trattamenti al calore Pastorizzazione Trattamento al vapore Dry heat Trattamenti sovente-detergente TriNButylPhosphate – Tryton X100 Trattamento al vapore Dry heat Nanofiltrazione Trattamento al blu di metilene Amatosalene - UV

Pathogen inactivation Perdita di proteine Costo Tossicità sul ricevente Danno alle cellule Alchilanti (S-303, PEN110) Riboflavina Eritrociti Psoralene - UV Riboflavina - UV Piastrine