MIDOLLO ADULTO dei MAMMIFERI COMPRENDE Cellula Staminale Ematopoietica Cellula Staminale Mesenchimale

IL MIDOLLO OSSEO

Ematopoiesi Ininterotta formazione di elementi giovani del sangue a partire da cellule staminali totipotenti: origine a tutte le linee emopoietiche Organi emopoietici: forniscono il microambiente necessario per la proliferazione e il differenziamento verso le varie linee cellulari

Organi emopoietici Organi mieloidi: midollo osseo Organi linfoidi: timo e midollo osseo Organi linfoidi secondari o periferici: linfonodi, tonsille palatine, placche di Peyer, tessuto linfoide diffuso, milza

Principi che giustificano l’utilizzo dei saggi funzionali su Cellule Ematopoietiche Il Sistema Ematopoietico rappresenta un continuum di cellule che progressivamente manifestano differenti caratteristiche biologiche: … da cellula staminale a … vari tipi cellulari differenziati; Variazioni biologiche rilevate nei vari compartimenti “maturanti” non riflettono quelle che si attuano nel compartimento staminale; I vari compartimenti ematopoietici sono controllati da differenti fattori che variano indipendentemente l’uno dall’altro.

Wu et al, 1967; Iscove et al., 1971; Metcalf et al. 1975. IDENTIFICATION OF HEMATOPOIETIC STEM/PROGENITOR CELLS: STRENGTH AND DRAWBACKS OF FUNCTIONAL ASSAYS. Oncogene, 2004, 23, 7210-7222 Wu et al, 1967; Iscove et al., 1971; Metcalf et al. 1975. Standardizzazione dei primi saggi funzionali; Rivelazione dei concetti che definiscono la biologia della cellula staminale ematopoietica; Possibile estensione degli stessi concetti alla comprensione dei meccanismi biologici che regolano la sopravvivenza e proliferazione della cellula staminale tumorale nonché delle cellule staminali non-ematopoietiche.

Short-term in vitro Assays I prototipi dei saggi funzionali a breve termine sono rappresentati dai saggi a colonie; La sospensione cellulare viene quindi piastrata in terreno semisolido rappresentato da metilcellulosa oppure da agar.

… la progenie che deriva da una singola cellula costituisce COLONIA Diversa composizione; Diversa grandezza; Diverso colore. Ogni colonia rappresenta un continuum di progenitori “lineage committed”.

SAGGI A COLONIE

…dopo circa 3 Settimane cioè a 5-10 Divisioni

Nell’ambito di un data linea cellulare, i progenitori con differenti livelli di maturità possono essere riconosciuti in base a: Sensibilità di risposta ai fattori di crescita; Tempo necessario per generare una progenie di cellule differenziate; La grandezza e la particolare morfologia delle colonie.

… Sensibilità, Tempo e Grandezza … Questi tre parametri sono stati utilizzati per l’ottenimento di mature CFU-E Colony-forming Unit Erythroid da immature Burst-forming Unit Erythroid

Il progenitore T linfoide migra nell’abbozzo del timo, ed in questa sede progressivamente si differenzia nei vari tipi di linfociti attraverso un processo che è caratterizzato da eventi molecolari specifici, e che è sotto controllo del microambiente timico. Il progenitore mieloide invece differenzia progressivamente nelle diverse linee ematopoietiche caratterizzate , da un punto di vista sperimentale, in base alla capacità di formare colonie (CFU, Colony Forming Units) o “burst” (Burst Forming Unit) in mezzo semisolido sotto lo stimolo di fattori di crescita ematopoietici specifici, denominati “Colony Stimulating Factors” (CFS) e interleuchine, che sono rilasciati fisiologicamente da vari tipi cellulari ( cellule staminali del midollo, monociti-macrofagi, linfociti T e NK).

Cellule progenitrici della serie eritroide (BFU-E e CFU-E) progenitori iniziali e più differenziati rispettivamente Cellule progenitrici della serie granulo-macrofagica (CFU-GM, CFU-G e CFU-M) Cellule progenitrici della serie megacariocitaria (BFU-MK, CFU-MK)

L’interleuchina 3 (IL-3) ed il granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF): inducono la differenziazione dei progenitori iniziali (BFU-E e CFU-GM) L’eritropoietina, l’interleuchina 5 (IL-5), il GM-CSF ed il macrophage colony stimulating factor (M-CSF): agiscono essenzialmente sulla proliferazione e\o differenziazione dei progenitori più avanzati (CFU-E, CFU-G, CFU-M, rispettivamente) e sull’attivazione delle cellule terminali mature.

LA PROLIFERAZIONE CELLULARE 2. POTENZIALE DIFFERENZIATIVO. La proliferazione cellulare è misurata attraverso il numero di cellule prodotte. 2. POTENZIALE DIFFERENZIATIVO. Il potenziale differenziativo è stimato attraverso il numero di differenti linee cellulari rappresentate nella progenie prodotta.

Tutti i Saggi Funzionali misurano 2 Parametri: LA PROLIFERAZIONE CELLULARE; POTENZIALE DIFFERENZIATIVO.

Stem Cell molto immatura. Limite dei Saggi a Colonie a Breve Termine Non risultano adeguati nel rilevamento di progenitori più immaturi Inadeguatezza dei mezzi semisolidi utilizzati; L’efficacia di un mezzo semisolido non supera le tre settimane e tutto questo conduce All’impossibilità di identificare una Stem Cell molto immatura.

… Una Stem Cell molto immatura necessita di un periodo superiore a 3 - 5 settimane affinchè possa garantire una progenie di cellule differenziate.

Michael Dexter, 1977 Long - Term Culture Presenza di un feeder layer costituito da cellule che da un lato fungono da substrato e dall’altro provvedono a secernere fattori di crescita nel tentativo di ricostituire il microambiente ematopoietico

Feeder Layer Cellule normali aderenti midollari allogeniche, espanse per 4 settimane e successivamente irradiate; Linee cellulari continue murine derivate dallo stroma midollare.

Linee Cellulari Continue Murine Le più note sono MS5, S17, AFT024 ed M210B4; Esse hanno il pregio di essere più facilmente gestibili rispetto alle cellule stromali fresche allogeniche; L’ottenimento del loro numero è ILLIMITATO; Supportano egualmente bene sia la differenziazione mieloide che quella linfoide a partire da progenitori lineage-committed.

UNITA’ EMATONE STROMA + CELLULE EMATOPOIETICHE CELLULE NON-EMATOPOIETICHE (Cellule Mesenchimali) L’Unità Ematone è quindi una delle strutture funzionali elementari rappresentata da un aspirato midollare che è indispensabile per la comprensione dei meccanismi biologici che regolano in vivo la Cavità della Cellula Staminale ovvero Stem Cell Niche.

Trends in Biotechnology, 2003 STROMA Le cellule stromali nel loro insieme sono costituite da adipociti, cellule endoteliali, macrofagi e fibroblasti. Trends in Biotechnology, 2003

Molecole di Adesione, Fattori di crescita e… P-selectin IL6 G-CSF GM-CSF M-CSF SCF Flk-2 VEGF2R E-selectin CD105 endoglin VLA-4 VCAM-1 Molecole di Adesione, Fattori di crescita e… ICAM-1

VEGF2-R = Recettore per Vascular Endothelial Growth Factor 2; CD105 = Recettore per il Transforming Growth Factor; VCAM-1= Vascular Cell Adhesion Molecule-1; ICAM-1= Intercellular Adhesion Molecule-1; SCF= Stem Cell Factor; VLA-4= Very Late Antigen di tipo IV.

GM-CSF G-CSF M-CSF IL6 IL1 TNF-a TGF-b Macrofago

Concetto di Nicchia Stabile Microambiente per la cellula staminale; La nicchia è costituita da cellule e componente extracellulare che può ospitare una o più cellule staminali e controllarne l’autorinnovamento nonchè la produzione di progenie; La matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione definiscono i confini spaziali della nicchia e modulano l’espressione di molecole di adesione nonchè quelle deputate al signalling.

Concetto di Nicchia La scelta di una cellula staminale se rimanere nel suo stato di quiescenza o dividersi guidata dal microambiente. -Angiopoietin-1 (Ang-1): il fattore secreto dagli osteoblasti e il suo recettore (Tie2) hanno grande importanza per il contatto delle HSC alle cellule della nicchia mantenendole in uno stato di quiescenza -p21: controlla il numero delle cellule staminali, mantenendo la popolazione staminale in uno stato di quiescenza -p27: controlla la proliferazione dei precursori ematopoietici e il loro pool all’interno dell’organismo -Growth factor independent 1 (Gfi-1): regola la proliferazione delle cellule T

Stem cells find their niche ALLAN SPRADLING, DANIELA DRUMMOND-BARBOSA & TOSHIE KAI Nature, 2001

Figure 1 Niche structure Figure 1 Niche structure. Niche cells (green) underlying a basement membrane signal to stem cells (red) to block differentiation and regulate division. When a lineage mechanism prevails (lower mitotic cell), the stem cell divides such that one daughter retains its connections to the niche, while the other (yellow) becomes untethered and begins to differentiate. When a population mechanism prevails (upper mitotic cell), stem cell division may be either symmetric (shown) or asymmetric (not shown), as determined by local factors. ECM, extracellular matrix.

Lemischka et al. Nature 425: 778, 2003 Figure 1 Birth control for stem cells. The niche that regulates the birth and differentiation of blood-forming (haematopoietic) stem cells is formed of osteoblasts (a type of bone-marrow cell) that line the inner surface of bone. Zhang et al.7 showed that depleting osteoblasts of a receptor for bone morphogenetic protein (BMP) caused a doubling in both the osteoblast population and the stem-cell population. Calvi et al.8 found a parallel expansion of the stem-cell population when they increased the numbers of osteoblasts by using parathyroid hormone (PTH). Lemischka et al. Nature 425: 778, 2003

Colture a Lungo Termine Identificano: LTC-IC; CAFC; Extended LTC-IC ovvero ELTC-IC.

LTC-IC La “Long-Term Culture Initiating Cell” identifica un tipo cellulare che è in grado, quando coltivata su un supporto costituito dallo stroma, di dare origine a cellule figlie identificabili mediante l’applicazione di saggi a colonie. La LTC-IC rappresenta, quindi, la primitiva cellula ematopoietica che è in grado di sostenere la produzione di tutte le linee cellulari ematopoietiche per l’intera vita di un individuo.

CAFC La “cobblestone area-forming cell” identifica un tipo cellulare che si integra nello strato aderente stromale. La colonia cellulare è costituita, pertanto, da cellule appiattite, otticamente dense e strettamente associate alle cellule aderenti.

Cobblestone Area. La CA è composta da cellule scure, angolari, associate ad una cellula adiposa (F). Si osservano cellule in sospensione (S), brillanti, ed un macrofago (M). Patricia Denning-Kendall et al, Stem Cells, 2003

Extended LTC-IC ovvero ELTC-IC L’Extended LTC-IC probabilmente identifica un tipo cellulare la cui longevità è strettamente associata a quella attesa per una vera e propria cellula staminale. ELTC-IC si ottiene estendendo il saggio LTC-IC ad un periodo superiore a 12 settimane.

Identificazione di Precursori Linfoidi B I precursori ad habitus B sono stati necessariamente assegnati in coltura liquida su feeder stromale murino utilizzando “Murine Dexter-type long-term bone marrow cultures”. Linee cellulari continue stromali murine utilizzate: Sys-1, S17, MS-5 ed AFT024.

… Perché è stato necessario utilizzare questa tecnica? La discriminazione morfologica di colonie B da colonie non-B non è accurata; La caratterizzazione immunofenotipica su colonie direttamente prelevate da metilcellulosa non è indicata; E’ essenziale l’utilizzo di basse concentrazioni di siero; Le citochine prodotte da granulociti e macrofagi inibiscono la differenziazione di progenitori B (Interferon-a ed IL-6).

Identificazione e Quantizzazione di Precursori Linfoidi T SISTEMI UTILIZZATI Coltura di timo fetale (FTOC, fetal thymus organ culture); Coltura di riaggregati e monolayer di cellule stromali timiche; Coltura della linea cellulare continua murina stromale, OP9 che esprime il ligando Notch Delta-1. Da notare che: La trasduzione del segnale via Notch-ligand è determinante per il differenziamento T; In questi tipi di sistemi è stato ottenuto il differenziamento CD4 a partire da 100 staminali cordonali CD34+.

H. Spits. Development of ab T cell in the human thymus H. Spits. Development of ab T cell in the human thymus. Nature Reviews Immunology, 2002.

Immunofenotipo delle HSCs CD34: HSCs e precursori ematopoietici Cellule in divisione: CD34+ CD38- Cellule quiescenti: CD34- CD38+ CD201: espresso anche nelle endoteliali, coinvolto nella coagulazione del sangue e nei processi infiammatori CD133: HSCs e precursori ematopoietici CD45, CD43, Flt3….

SIMPLIFIED SCHEME OF STEM CELL DIFFERENTIATION hematopoietic stem cell myeloid blast erythroid CD34 CD117 CD133 CD90 VEGFR CD105 ALDH ABCG2 ABCB1 CDCP1 CD318

Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche Con il termine Homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero “nicchia” nel midollo osseo.

Fasi di Homing Le varie fasi di Homing di una cellula staminale ematopoietica prevedono: Rolling sulle cellule endoteliali attraverso il legame con E e P-Selectine; Adesione attraverso VCAM-1 espresso dalle stesse cellule endoteliali; Migrazione trans-endoteliale via VLA-4/VCAM-1 come anche via VLA-4 e VLA-5/Fibronectina.

Perché è importante aumentare l’efficienza di Homing? Perché soltanto il circa 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la nicchia midollare dell’ospite! La percentuale è leggermente variabile e correla con lo stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate;

Christopherson et al, Science 2004 Modulation of Hematopoietic Stem cells Homing and Engrafment by CD26 Uno dei protagonisti che limita fortemente l’Homing e quindi l’attecchimento dei progenitori primitivi ematopoietici è la molecola CD26. CD26 è una DPPIV/Dipeptidilpeptidasi IV che ha la funzione di rimuovere dipeptidi dalla estremità aminoterminale delle proteine.

CXCR4 Le cellule stromali producono SDF-1 che attrae le cellule positive per CXCR4. :-) SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1 SDF-1

Struttura generale dei recettori per chemochine CXCR4 Struttura generale dei recettori per chemochine NH2 1 2 3 4 5 6 7 Sette domini transmembrana HOOC

:-( CXCR4 CD26 cliva SDF-1 bloccando il meccanismo chemiotattico CD26

“Esaltatore di Homing” AMD3100 “Mobilizzatore” CXCR4 :-) CD26 Diprotin-A “Esaltatore di Homing”