“I parametri spermatici non convenzionali: indicazioni a una diagnostica di II livello” Rosita A. Condorelli Andrologia ed Endocrinologia Policlinico “G.Rodolico”, Università di Catania

Perché eseguire i parametri di II livello? Forniscono dati sulla “funzionalità” nemaspermica Sede e natura del danno Spiegano quei casi di infertilità definiti idiopatici

Evidenze della letteratura

Parametri II livello Compattazione della cromatina nemaspermica Frammentazione del DNA nemaspermico Funzione mitocondriale (MMP) Apoptosi nemaspermica (esternalizzazione della PS) Conta dei leucociti nel liquido seminale 8-idrossi,2-desossiguanosina Perossidazione lipidica

Compattazione della cromatina Il processo di compattazione della cromatina è importante per l’adeguato impacchettamento del materiale genetico e quindi per il suo sicuro trasferimento all’oocita Infatti, tale processo ha inizio durante la spermiogenesi (spermatidi in spermatozoi maturi), dove oltre alla forma delle cellule (espulsione del citoplasma, formazione del flagello e dell’acrosoma, riarrangiamento dei mitocondri), anche i nuclei assumono diversa conformazione Inizialmente si formano i nucleosomi, DNA complessato con proteine denominate istoni collegati da regioni di DNA di collegamento (aspetto a “collana di perle”) Successivamente gli istoni subiscono un processo di acetilazione che riducendo l’affinità di questi per il DNA ne permette il distacco da essi 5

Compattazione della cromatina Queste ultime sono sostituite dalle protamine il cui ruolo principale è quello di provvedere alla condensazione finale della cromatina e alla sua stabilizzazione La stabilità della cromatina è determinata dal numero di legami disolfuro (ossidazione dei gruppi tiolici) della cisteina presente in protamine adiacenti Si formano così, subunità toroidali contenenti ciascuna circa 50 kb di DNA. Al termine del processo il DNA sarà formato da 50.000 strutture toroidali all’interno del nucleo dello spermatozoo La valutazione del numero di legami disolfuro delle protamine ha permesso di dimostrare che la stabilizzazione della cromatina ha inizio nel testicolo e continua nell’epididimo durante il passaggio degli spermatozoi lungo tale tratto 6

Tecniche Le tecniche per la determinazione dell’integrità cromatinica finora adottate sono: Test con arancio di acridina Test con ioduro di propidio Test con blu di anilina Test con cromomicina A3 Test con blu di toluidina

Compattazione della cromatina Test con ioduro di propidio Soggetto con normale compattazione cromatinica Soggetto con alterata compattazione cromatinica PI entra all’interno delle cellule dopo adeguata permeabilizzazione della membrana cellulare e tanto più la cromatina è compatta tanto meno esso potrà legarsi ad essa 8

Frammentazione del DNA spermatico Perché il DNA si frammenta? Il processo con cui ciò avviene non è del tutto chiaro Persistenza degli istoni che determinano instabilità cromatinica durante la spermiogenesi Quando il DNA è complessato alle protamine e quindi molto stabile, diventa resistente agli enzimi digestivi. McPherson e Longo nel 1992, hanno osservato la presenza di filamenti di DNA danneggiato e hanno proposto che essi potrebbero essere dovuti a un’errata sostituzione degli istoni con le protamine. Tali filamenti devono essere di nuovo compattati e legati per azione degli enzimi nucleari come la topoisomerasi II e se questo non ha luogo il DNA rimane frammentato Infatti è nota la correlazione fra DNA frammentato e alterata compattazione della cromatina (Manicardi et al, 1998) e un aumento della sensibilità alla denaturazione 9

Topoisomerasi II

Stress ossidativo Apoptosi Frammentazione del DNA spermatico Perché il DNA si frammenta? Il processo con cui ciò avviene non è del tutto chiaro. Persistenza degli istoni che determinano instabilità cromatinica durante la spermiogenesi Quando il DNA è complessato alle protamine e quindi molto stabile, diventa resistente agli enzimi digestivi. McPherson e Longo nel 1992, hanno osservato la presenza di filamenti di DNA danneggiato e hanno proposto che essi potrebbero essere dovuti a un’errata sostituzione degli istoni con le protamine. Tali filamenti devono essere di nuovo compattati e legati per azione degli enzimi nucleari come la topoisomerasi II e se questo non ha luogo il DNA rimane frammentato. Infatti è nota la correlazione fra DNA frammentato e alterata compattazione della cromatina (Manicardi et al, 1998) e un aumento della sensibilità alla denaturazione Stress ossidativo Apoptosi 11

Tecniche Le tecniche finora utilizzate per la valutazione della frammentazione del DNA spermatico sono: Comet TUNEL SCSA Esiste una mancanza di consenso, non tanto sulla tecnica da utilizzare quanto sui valori di riferimento da adottare (TUNEL)

TUNEL Il test TUNEL è basato sulla capacità dell’enzima TdT di riconoscere e legare le estremità 3’OH libere che si trovano a livello dei filamenti di DNA liberi e quindi interrotti. Tale enzima viene omesso nel controllo negativo che ci permette di rilevare la esatta % di cellule con DNA frammentato Due metodi possono essere adottati sulla base del controllo negativo: Threshold-setting (fissando una soglia sul controllo negativo) Subtraction-blank (sottraendo l’istogramma del controllo negativo da quello del campione in esame)

TUNEL Soggetto con normale frammentazione del DNA DNA-fragmentation Soggetto con normale frammentazione del DNA (controllo negativo sovrapponibile al campione in esame)

TUNEL Soggetto con elevata frammentazione del DNA DNA-fragmentation Soggetto con elevata frammentazione del DNA (controllo negativo e campione in esame)

Conseguenze di DNA alterato Spermatozoi eiaculati con DNA alterato, indipendentemente dall’entità del danno, fertilizzano gli oociti allo stesso modo di spermatozoi normali (Ahmadi and Ng, 1999) Anche se l’oocita ha la capacità di riparare danni pre-esistenti del DNA spermatico, al di sopra di una certa soglia la sua capacità riparativa diventa inadeguata (Ahmadi and Ng, 1999) Se il DNA non è capace di decondensarsi dopo essere entrato nel citoplasma dell’oocita la fertilizzazione potrebbe fallire o arrestarsi (Tomsu et al, 2002); inoltre esiste anche il rischio che all’aumentare del grado di danno del DNA aumenti la probabilità di perdere una gravidanza 17

Conseguenze di DNA alterato … e sui parametri spermatici? Studi animali indicano che la frammentazione del DNA valutata con SCSA è scarsamente correlata ai parametri convenzionali del liquido seminale (Everson et al, 1999) Altri studi hanno sottolineato l’associazione fra la presenza di danno al DNA spermatico e alterati parametri convenzionali (Sun et al, 1997; Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000) Gli spermatozoi con tali anomalie sono meno mobili, più immaturi e meno responsivi al test ipo-osmotico, e ciò sta ad indicare una scarsa funzionalità e integrità della membrana (Jeyendan et al, 1984) Inoltre la presenza di DNA frammentato è associata con la presenza di residui citoplasmatici nelle cellule spermatiche (Muratori et al, 2000) Correlazione fra frammentazione del DNA (TUNEL) si ha con: - età, motilità totale, motilità progressiva rapida, vitalità, forma normali Nessuna correlazione invece si riscontra con: - densità, volume, pH, alterazioni della testa e dell’acrosoma, leucociti e neutrofili (Cohn-Bacrie et al, 2009)

Dunque … Un basso DFI non assicura una fertilità normale Allo stesso modo, un DFI elevato non preclude la possibilità di avere una gravidanza normale a termine. Anche se gli spermatozoi con DNA alterato fertilizzano l’oocita, esiste la possibilità che si sviluppino anomalie genetiche nel nascituro 19

Funzione mitocondriale La motilità spermatica e quindi il movimento del flagello sono il risultato di un processo molecolare complesso (ossidazione dei substrati energetici, fosforilazione della proteine, conversione dell’energia da chimica a meccanica) L’ATP, indispensabile per tale processo, viene prodotto in differenti regioni del flagello attraverso la fosforilazione ossidativa (mitocondri) e la glicolisi La quota più rilevante di ATP viene però prodotta attraverso la fosforilazione ossidativa L’MMP, è il parametro che meglio riflette la funzione mitocondriale e rappresenta un importante indicatore dello stato energetico del mitocondrio 20

Funzione mitocondriale Vari studi hanno evidenziato la correlazione fra alterata funzionalità mitocondriale , dimostrata da una riduzione dell’MMP e la riduzione della motilità spermatica e la capacità riproduttiva (Troiano et al, 1998; Kasai et al, 2002; Wang et al, 2003) Gallon et al, 2006 hanno dimostrato che spermatozoi con MMP elevato presentavano una maggiore % di forme normali, motilità più elevata, migliore capacità di realizzare la reazione acrosomiale Recentemente Paoli et al, 2011, hanno mostrato una correlazione positiva fra MMP e motilità totale in 230 soggetti. Inoltre, la % di spermatozoi con elevato MMP correlava positivamente con la vitalità spermatica 21

JC-1 Il JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) è la sonda più affidabile e specifica per la valutazione del potenziale di membrana mitocondriale (Lugli et al, 2007) Nelle cellule con potenziale di membrana conservato, si trova in forma monomerica nel citosol (verde) e si accumula inoltre come aggregato nei mitocondri (all’interno dei quali penetra grazie alla carica negativa del potenziale di membrana intatto ed essendo lipofilica) dove emette in arancio. Nelle cellule con potenziale di membrana alterato resta, invece, in forma monomerica nel citosol (verde) in quanto non può accumularsi all’interno del mitocondrio a causa del potenziale danneggiato 22

JC-1 Soggetto con più elevato numero di cellule con potenziale di membrana ridotto Soggetto con assenza di cellule con potenziale di membrana ridotto

Conseguenze di MMP alterato Un studio recente ha esaminato 91 coppie che si sottoponevano PMA e messo in correlazione il potenziale di membrana degli spermatozoi con i risultati ottenuti Da tale studio emerge che il potenziale di membrana è in correlazione con il tasso di fertilizzazione e con la motilità spermatica Nessuna relazione con la qualità embrionale Nessuna coppia raggiungeva la gravidanza se più del 64% degli spermatozoi presentava potenziale danneggiato Marchetti et al, 2011

Apoptosi nemaspermica ANN-V

Conta dei leucociti nel liquido seminale Recentemente, la valutazione delle sottopopolazioni leucocitarie nell’eiaculato sembra acquisire una rilevanza clinica sempre maggiore (Seshadri et al., 2011) Leucociti nell’eiaculato: procedura istochimica che identifica l’enzima perossidasi, caratteristico dei granulociti Questa tecnica non individua i polimorfonucleati attivati che hanno rilasciato i loro granuli e tutti gli altri tipi di leucociti (linfociti, macrofagi e monociti) che non contengono perossidasi, né la presenza di altre sottoclassi di leucociti Infezione/infiammazione presente o meno, senza definire la causa di essa (batterica, virale, acuta o cronica) “Formula leucocitaria” nel liquido seminale Importanza diagnostica e terapeutica

Conta dei leucociti nel liquido seminale Neutrofili, macrofagi e monociti Linfociti T-helper Linfociti T-suppressor

8-idrossi,2-desossiguanosina Stress ossidativo 8-idrossi,2-desossiguanosina Perossidazione lipidica

M540 bodies

Conclusioni Ma non solo … A chi richiedere i parametri di II livello del liquido seminale? Aborti ripetuti Età avanzata Chemioterapie o altri trattamenti Patologie sistemiche determinanti stress ossidativo (DM, IR, ecc..) Ma non solo …

1025 pazienti Flow-chart: indicazioni alla diagnostica di II livello Esame del liquido seminale Numero leucociti ROS Perossidazione lipidica 8-idrossi,2-desossiguanosina Terapia antiossidante Conta leucocitaria Terapia antinfiammatoria Spermiocoltura positiva Terapia antivirale Terapia antibiotica Spermiocoltura negativa Motilità Vitalità Funzionalità mitocondriale Apoptosi nemaspermica Compattazione cromatinica Frammentazione DNA Terapia pro-cinetica Normale Elevato Viscosità pH Agglutinazioni/aggregazioni Macrofagi, spermiofagi ecc.. 1025 pazienti Esame del liquido seminale Esami II livello

Flow-chart: indicazioni alla diagnostica di II livello ROS Esame del liquido seminale Normale Viscosità pH Agglutinazioni/aggregazioni Macrofagi, spermiofagi ecc.. Perossidazione lipidica Numero leucociti Motilità Vitalità Elevato 8-idrossi,2-desossiguanosina Spermiocoltura positiva Spermiocoltura negativa Funzionalità mitocondriale Terapia antiossidante Terapia antibiotica Apoptosi nemaspermica Conta leucocitaria Compattazione cromatinica Terapia antinfiammatoria Frammentazione DNA Terapia antivirale Terapia pro-cinetica

nei casi di “infertilità idiopatica” Conclusioni A chi richiedere i parametri non convenzionali del liquido seminale? Aborti ripetuti Età avanzata Chemioterapie o altri trattamenti Patologie sistemiche determinanti stress ossidativo (DM, IR, ecc..) Ma non solo… nei casi di “infertilità idiopatica”

Ringraziamenti Prof. Aldo E. Calogero Prof. Sandro La Vignera Prof. Enzo Vicari Prof. Maurizio Di Mauro Prof. Salvatore Tumino Dr. Filippo Giacone Specializzandi Dott.ssa Dr.ssa Laura Cimino Dott.ssa Laura Mongioì Dott.ssa Ylenia Duca Dr. Giovanni Burgio Biologi e tecnici di laboratorio Dr.ssa Nunziata Barone Dr.ssa Nunziatina Burrello Sig. Domenico Recupero Personale infermieristico Dr.ssa Concetta Costa Dr.ssa Caterina Leone Sig.ra Laura Pappalardo Dottorandi Dr.ssa Linda Iacoviello Dr. Carmelo Puglisi

** Grazie per l'attenzione ** 35

Analizza le fluorescenze emesse Citofluorimetria ANTIGENE ANTICORPO FLUOROCROMO La citometria a flusso è una metodica che permette di valutare parametri fisici e chimici di particelle biologiche o cellule contenute in una sospensione che passano attraverso un sistema di rilevazione ottico-elettronico Analizza le fluorescenze emesse

Vantaggi Svantaggi analisi di un alto numero di eventi bassi tempi di analisi (sec) scelta della popolazione da analizzare “gating“ analisi di eventi rari acquisizione contemporanea di 10 parametri per cellula Svantaggi non associa il dato derivato dall’analisi a quello morfologico

I nostri dati.. 1025 pazienti 1025 pazienti Esame del liquido seminale L’oligozoospermia e la astenozoospermia si associano ad un aumento della % di spermatozoi con danno mitocondriale, della cromatina e in apoptosi La teratozoospermia si associa ad un aumento della % di spermatozoi con danno mitocondriale e della cromatina 1025 pazienti 1025 pazienti Esame del liquido seminale Esami II livello Esame del liquido seminale Esami II livello