TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE Le tecniche analitiche si dividono in due grandi famiglie: tecniche separative e tecniche identificative. Le tecniche separative hanno come primo obbiettivo la separazione degli analiti nel campione. Sono impiegate quando i campioni sono molto complessi. La identificazione è affidata a tecniche di rivelazione adatte (es: spettrofotometria, spettrometria di massa).

LA CROMATOGRAFIA La cromatografia opera secondo lo stesso principio della estrazione ma una fase (fase stazionaria) viene mantenuta fissa ed un’altra passa attraverso di essa (fase mobile)

IL PICCO CROMATOGRAFICO Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. tr viene misurato nel punto di massimo del picco; W viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base W1/2 è la larghezza del picco misurata al 50% dell’altezza 2s è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso

IL PICCO CROMATOGRAFICO Altre caratteristiche del picco sono: l’area (l’integrale sotto il picco) che è proporzionale alla quantità di analita ed è quindi utilizzata per le analisi quantitative; l’altezza del picco, che viene misurata in corrispondenza del massimo del picco. Nel caso ideale di riproducibilità dei risultati e simmetria dei picchi elevate, anche l’altezza del picco può essere usata a scopi quantitativi. Area del picco Altezza del picco

IL PROCESSO SEPARATIVO Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi. Un analita che non interagisce con la fase stazionaria viaggia con la stessa velocità della fase mobile e viene eluito in un volume di fase mobile corrispondente al volume della colonna (volume morto, VM). Il tempo di eluizione di questo composto si chiama tempo morto (tM). Un composto che interagisce con la fase stazionaria viene ritardato ed eluisce in un volume di fase mobile maggiore (volume di ritenzione, VR), che corrisponde ad un tempo di eluizione caratteristico, chiamato tempo di ritenzione (tR). Per ogni composto si può calcolare un tempo di ritenzione corretto (t’R): t’R = tR - tM

A fase mobile A fase stazionaria PIATTI TEORICI La teoria dei piatti considera il sistema cromatografico come un sistema statico in equilibrio. Ciascun analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria. Ciascuno di questi equilibri definisce un piatto teorico A fase mobile A fase stazionaria I quattro concetti importanti per capire ed ottimizzare le condizioni separative sono: k’ Fattore di capacità  Selettività N Efficienza del sistema (numero di piatti teorici) R Risoluzione

EFFICIENZA SEPARATIVA Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per questo è utile ricavare l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), che generalmente si esprime in millimetri. lunghezza della colonna in mm L’efficienza è tanto più elevata quanto minore è H e maggiore è N. Il concetto di piatto è usato nella distillazione frazionata, dove si considera che ogni stadio di condensazione/evaporazione avvenga su un diverso livello o piatto (questi piatti esistono effettivamente in molte colonne di distillazione) In cromatografia i piatti sono una rappresentazione teorica degli stadi di ripartizione (distribuzione) che le molecole incontrano durante il loro passaggio nel sistema separativo.

FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale lungo la colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno sempre più larghi di quelli che escono prima. Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale.

MISURA DELL’ EFFICIENZA L’efficienza separativa è quindi definita dal numero di piatti ed è misurabile dalla larghezza del picco. Il numero di piatti teorici può essere calcolato conoscendo il tempo di ritenzione del picco e la sua ampiezza a metà altezza o ampiezza alla base. tR N= 5.54 Wh 2 tR = tempo di ritenzione wh = ampiezza a metà altezza tR N= 16 Wb 2 wb = ampiezza alla base

DETERMINAZIONE DI N tR N= 5.54 Wh 2 Poiché l’ampiezza a metà altezza può essere misurata con maggiore accuratezza, questa formula è preferita. Esempio: due picchi caratterizzati dallo stesso tempo di ritenzione e diverso numero di piatti teorici.

k’ (fattore di capacità) = (tR - tM) / tM = t’R / tM FATTORE DI CAPACITA` Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: k’ (fattore di capacità) = (tR - tM) / tM = t’R / tM Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore è il fattore di capacità, più alto è il tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria e più tardi il composto eluisce. Il fattore di capacità è indipendente dalla velocità di flusso e dal sistema in generale. E`una funzione della capacità di ritenzione del sistema separativo accoppiata alle interazioni della fase mobile.

CALCOLO DEL FATTORE DI CAPACITA` k’ (fattore di capacità) = (tR - tM ) / tM k’ = 1,7 k’ = 3,5 k’ = 5,2 2 4 6 8 10 12 14 tempo morto

SELETTIVITA’ La selettività viene misurata mediante  (fattore di separazione o ritenzione relativa), che è il rapporto dei fattori di capacità di due picchi.  La selettività misura le differenze di interazioni tra i composti e la fase stazionaria. = 1 per due picchi totalmente sovrapposti ed aumenta all’aumentare della separazione tra i due picchi. Un valore basso di  indica che la separazione dei due picchi è molto difficoltosa e richiede un’efficienza elevata. k = 1,7 k = 3,5 k = 5,2 2,3 = 1,5 1,2 = 2 volume morto 2 4 6 8 10 12 14

La risoluzione misura il grado di separazione tra due picchi. E’ calcolata come la differenza tra i tempi di ritenzione di due picchi divisa per l’ampiezza media dei due picchi alla linea di base. R (risoluzione) = 2 (tR(B) – tR(A)) / (Wb(A) + Wb(B) ) tR(A) tR(B) Wb(A) Wb(B)

DIPENDENZA DELLA RISOLUZIONE 1 - Fattore di Capacità. Descrive l’equilibrio che si instaura tra analiti - fase stazionaria e fase mobile. In genere si cerca di ottenere k’ compreso tra 2 e 10 per tutti gli analiti: k’<2 significa che l’analita è poco ritenuto; k’>10 comporta tempi di analisi lunghi ed allargamento del picco. 2 - Selettività. Esprime la posizione relativa di due picchi. Maggiore è la differenza tra i coefficienti di distribuzione degli analiti tra le due fasi, maggiore la selettività. Un aumento di selettività, aumenta la risoluzione. tr(A) tr(B) 3 - Efficienza. La larghezza del picco è funzione dell’efficienza. Maggiore è l’efficienza più stretti risultano i picchi e perciò migliore è la risoluzione. WA WB

SOMMARIO DELLE ESPRESSIONI

EQUAZIONE DELLA RISOLUZIONE

RISOLUZIONE E SEPARAZIONE

EQUAZIONE DI VAN DEEMTER

EQUAZIONE DI VAN DEEMTER

DIPENDENZA DEL FATTORE DI CAPACITA`

GAS CROMATOGRAFIA (GC)

Confronto tra colonne impaccate e capillari

Le colonne capillari

Confronto tra colonne capillari

Polarità: un criterio per scegliere la fase stazionaria

Alcune fasi stazionarie di uso comune per GLC capillare

Programmazione della temperatura di lavoro Confronto tra cromatografia a temperatura costante (isoterma, caso a) e a temperatura programmata (caso b) di idrocarburi lineari

TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC Equazione di Clausius-Clapeyron p = tensione di vapore DvH = variazione di entalpia di vaporizzazione I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna

INIETTORI PER GC

Iniettore splitt

Microestrazione in fase solida (SPE) m=massa analita estratto C0=conc. analita Vs=vol. soluzione Vf=volume del film fibra K= coeff partizione

Estrazione purge & trap Metodo per estrarre analiti volatili e concentrarli Il campione e’ estratto al 100% Purge gas: He Oven: 50 °C Flusso di purge invertito e trappola adsorbente deumidifcata a 25 °C Analiti in trappola desassorbiti a 200 °C e iniettati nel GC

RIVELATORI PER GC

Rivelatore a termoconducibilità (TCD)

Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)

Rivelatore a cattura elettronica (ECD)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA La Cromatografia Liquida è diventata una tecnica analitica indispensabile in molti settori: farmaceutico, biologico, biomedico, clinico e ….. ….forense: vediamo Catherine mentre prepara campioni per HPLC…. (da CSI, M. Helgenberger)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA Durante il processo cromatografico la velocità con la quale ciascun analita procede lungo la colonna dipende dalle interazioni che stabilisce con la fase mobile e stazionaria, quindi la separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione delle singole molecole nelle due fasi. La definizione HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) in origine riferita alle elevate pressioni di esercizio caratteristiche di questa tecnica, è stata oggi sostituita con High Performance Liquid Chromatography o semplicemente Liquid Chromatography (LC). HPLC

HPLC

IL SISTEMA HPLC I componenti fondamentali del sistema HPLC sono: una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione; un sistema di introduzione del campione; una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione; un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna; il grafico della risposta del rivelatore in funzione del tempo è chiamato cromatogramma.

IL SISTEMA HPLC miscelatore precolonna e colonna computer pompa rivelatore sistema di introduzione del campione raccoglitore di frazioni Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile

STRUMENTAZIONE HPLC

Pompa HPLC a pistoni reciprocanti

Iniettore HPLC a loop

LA COLONNA LC Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15-25 cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

TIPI DI LC SU COLONNA I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione: cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento. cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide. cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti. cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti.

LC DI SCAMBIO IONICO (IEC) + - flusso La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti. Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili. Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti.

LC DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) flusso La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata. Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole. Infatti le molecole che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna, rispetto a quelle che entrano nei pori. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni.

SEC di proteine intere 1: Tiroglobulina (669 kD) 2: Catalasi (669 kD) 3: BSA (67 kD) 4: Ovalbumina (43 kD) 5: Ribonucleasi (13.4 kD)

Esempi di fasi stazionarie per SEC

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE LC DI ADSORBIMENTO flusso La fase stazionaria è un solido. La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido. La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile (solubilità relativa). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso

LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO FASE NORMALE E IN FASE INVERSA Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa.

FASI STAZIONARIE PER LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata.

SUPERFICIE DI UNA PARTICELLA DI SILICE PER LC

MORFOLOGIA DI FASI SILICEE Struttura porosa a particelle aggregate Struttura microporosa Struttura monolitica

FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP) OH FASE STAZIONARIA LIQUIDA La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. SUPPORTO SILICEO

DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura, espresso in mol/m2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. Si O OH

DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (END-CAPPING) I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inaccessibili alle molecole di soluto. Si O OH

FASI MOBILI IN LC In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

SCELTA DELLA FASE MOBILE IN LC La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

SOLVENTI PER FASI MOBILI LC Non tutti i solventi possono essere utilizzati in LC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in LC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

SERIE ELUOTROPICA E CUTOFF UV DI SOLVENTI PER FASI MOBILI

Gradiente di fase mobile Alcol benzilico Fenolo 3’-4’dimetossiacetofenone Benzoino Benzoato di etile Toluene 2,6-dimetossitoluene o-metossibifenile

Tecniche LC: criteri di scelta / P.M.< 2000

Tecniche LC: criteri di scelta / 2000<P.M.< 105-6

Accoppiamento tecniche separative/MS Caratteristiche di un rivelatore ideale per tecniche separative Non alterare la risoluzione, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati. Avere la massima sensibilità possibile. Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti. Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti eluiti, per permetterne l’identificazione. Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in miscela. Dare un segnale proporzionale alla concentrazione. Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile. Non danneggiare i prodotti. Non produrre artefatti. Consentire la deconvoluzione dei picchi, ossia la scomposizione dei picchi non risolti nei solo componenti. Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile.

Rivelatori per LC

Rivelatore ad indice di rifrazione (RI)

Rivelatore RI: disegno costruttivo

BASI DELLE SEPARAZIONI ANALITICHE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE

ESTRAZIONE IN CONTROCORRENTE