Crioconservazione di gameti ed embrioni Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Centro Ambra- Palermo Centro Bios -Roma

La criobiologia ha molto a che fare con l’acqua: si può ricondurre infatti alla maniera di congelare l’acqua intracellulare senza uccidere le cellule.

La crioconservazione è una branca della criobiologia che consente il mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di –196°C in azoto liquido.

Il principio fondamentale della crioconservazione è quello di interrompere i processi biochimici del metabolismo cellulare. Ciò si ottiene convertendo in ghiaccio (CONGELAMENTO), a temperature sufficientemente basse, l’acqua presente all’interno delle cellule.

La crioconservazione è valida se il sistema biologico torna a temperatura normale (SCONGELAMENTO) senza dover sopportare insulti strutturali o biochimici che possano causarne la morte cellulare.

È POSSIBILE CRIOCONSERVARE Spermatozoi Tessuto testicolare Ovociti Tessuto ovarico Zigoti Preembrioni prima della compattazione Blastocisti

SPERMATOZOI E TESSUTO TESTICOLARE

Preservare la potenzialità riproduttiva BANCA DEL SEME Autoconservazione degli spermatozoi Preservare la potenzialità riproduttiva Soggetti ipofertili Soggetti con azoospermia Soggetti che si sottopongono a vasectomia Soggetti che devono sottoporsi a chemio e/o radioterapia

La crioconservazione è fondamentale nei casi in cui si assiste ad progressivo abbattimento dei valori di concentrazione, motilità e morfologia nemaspermica.

La possibilità di crioconservare il liquido seminale è di notevole vantaggio per la gestione dei protocolli terapeutici finalizzati alla procreazione assistita

La crioconservazione risulta essere una procedura prioritaria ed imprescindibile nei casi di AZOOSPERMIA quindi per SPERMATOZOI TESTICOLARI

Si procede alla CRIOCONSERVAZIONE ICSI Qualunque sia la tecnica di prelievo a livello testicolare MESA TESA TESE PESA TFNA Si procede alla CRIOCONSERVAZIONE ICSI

Vantaggi della crioconservazione di spermatozoi testicolari Possibilità di raccogliere e studiare campioni testicolari di pazienti gravemente oligoastenospermici o azoospermici in fase diagnostica, quindi prima che la partner venga sottoposta a stimolazione della crescita follicolare multipla per l’ esecuzione della fecondazione in vitro mediante ICSI.

La crioconservazione non modifica i risultati di fertilizzazione, formazione di embrioni e possibilità di gravidanza se la motilità degli spermatozoi è anche parzialmente conservata

OVOCITI ED EMBRIONI

Ci sono così poche pubblicazioni sulla crioconservazione di ovociti La tecnica è considerata poco efficiente In alcuni paesi ci sono restrizioni legali (Francia) Le uniche indicazioni valide sono: rifiuto della crioconservazione di embrioni conservazione della fertilità divieto di congelare zigoti o embrioni. 16

E’ vietata la crioconservazione degli embrioni. 2004 Legge 40 Art. 14 – Limite all’applicazione delle tecniche. E’ vietata la crioconservazione degli embrioni. “Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione e' consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile.”

TECNICHE DI CRIOCONSERVAZIONE Sloow cooling – congelamento lento Vitrificazione – congelamento rapido

OVOCITI IN Metafase II: risultati Polak de Fried et al, FS 1998 2 ovociti fecondati : nascita di un maschio sano Antinori et al, ESHRE 1998 38 transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing Young et al, FS 1998 9 ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws) Trounson et al, ESHRE 2000 3 bambini nati Molto incoraggianti ma solo l’ 1% di nati 19

MODIFICHE AL PROTOCOLLO portano al miglioramento dei risultati in termini di sopravvivenza ovocitaria Porcu et al., 2000 sopravvivenza 54% Fabbri et al., 2001 sopravvivenza 82% Fosas et al., 2003 sopravvivenza 89% Chen et al., Borini et al. 2005 sopravvivenza 75-80% Ancora non soddisfacente il numero di bambini nati 20

Crioconservazione di ovociti Efficienza La crioconservazione degli ovociti è stata considerata una tecnica a bassa efficienza a causa della bassa sopravvivenza, fertilizzazione e capacità di divisione dell’embrione. Il miglioramento dei protocolli di congelamento ha reso la tecnica più soddisfacente in termini di sopravvivenza degli ovociti allo scongelamento, Con l’ introduzione dell’ ICSI sono migliorati i risultati anche in termini di fecondazione, di formazione degli embrioni e di impianto.

La sopravvivenza allo scongelamento è l’unico criterio per valutare la qualità degli ovociti crioconservati La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo non sono necessariamente correlate con criteri clinici o morfologici. L’assenza di degenerazione dopo scongelamento non è un indicatore attendibile della vitalità. La sopravvivenza deve coincidere con la conservazione dei fattori morfofunzionali essenziali verificabili oggettivamente.

VITRIFICAZIONE Si basa sul concetto fisico della solidificazione senza formazione di cristalli di ghiaccio così come avviene nel congelamento lento.

L’interesse verso questa tecnica ha avuto un grosso incremento negli ultimi anni

Kuleshova et al., nel 1999 riportarono la prima nascita dopo vitrificazione e scongelamento di 17 ovociti

CONFRONTO TRA SLOW FREEZING E VITRIFICAZIONE AUTORE METODO % SOPRAV % FERT N° OVO/GRAV Fabbri, 2001 SF 53 79 94 Chen, 2005 75 67 23 Boldt, 2006 60 61 26 Yoon, 2003 VF 68.6 71.7 Kuwayama, 2005 91 90 5 Cobo, 2007 97 76.3 11 Yoon, 2007 85.1 77.4 21

Risultati della vitrificazione di ovociti AUTORE N° CASI N° OVO SCONG SR % N° CG NATI Kuleshova, 1999 4 17 65 1 Wu, 2001 36 79 59 Yoon, 2003 34 474 69 8 7 Kim, 2003 16 51 80 Chian, 2005 15 180 94 11 Kuwayama, 2005 67 107 12 Katayama, 2003 6 46 2 Kyono, 2005 5 100 Lucena, 2006 23 159 75 13 Selman, 2006 24 3 Yoon, 2007 28 364 85 Antinori, 2007 120 330 99 39

I migliori risultati pubblicati nel 2007 riportano: - sopravvivenza ovocitaria 85% - gravidanze 43,5 %

Verificare l’efficacia della vitrificazione di ovociti. E’ IN CORSO UNO STUDIO MULTICENTRICO SULLA VITRIFICAZIONE DI OVOCITI proposto dalla Scopo Verificare l’efficacia della vitrificazione di ovociti. Lo studio è stato approvato dal comitato di bioetica dell’Università di Pisa è stato avviato a settembre 2007 e sono già stati vitrificati circa 150 ovociti. È previsto il congelamento di ovociti in MII, con caratteristiche morfologiche ottimali e provenienti da pazienti di età inferiore a 38°.

OVOCITI O EMBRIONI? PRO Ovociti Embrioni Superamento problemi etico-legali Preservazione della fertilità in pazienti oncologiche o con problemi diversi. Recupero degli ovociti quando il seme non è disponibile Embrioni Riproducibilità dei risultati Omogeneità degli standard operativi Verifica sui nati

OVOCITI O EMBRIONI? CONTRO Problemi biologici Inevitabilità della ICSI Tecnica sperimentale Embrioni Problemi etici e legali Embrioni“abbandonati”

ZIGOTI ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA CRIOCONSERVAZIONE VERIFICA DELLA VITALITA’ POTENZIALITA’ DI IMPIANTO SIMILE AGLI EMBRIONI FRESCHI

EMBRIONI BUONA SOPRAVVIVENZA SE LA MORFOLOGIA E’ OTTIMALE LIMITATA POSSIBILITA’ DI OSSERVARE LA RIPRESA DELLE DIVISIONI DEI BLASTOMERI POTENZIALITA’ DI IMPIANTO INFERIORE AGLI EMBRIONI FRESCHI

BLASTOCISTI SELEZIONE DEGLI EMBRIONI PIU’ VITALI cavità Inner cell mass trofoblasto SELEZIONE DEGLI EMBRIONI PIU’ VITALI MINOR NUMERO DI CONGELAMENTI MAGGIORE NUMERO DI CELLULE MINORI DIMENSIONI DELLE CELLULE LE BLASTOCISTI OTTENUTE IN VITRO CON I TERRENI SEQUENZIALI RESISTONO MALE ALLA CRIOCONSERVAZIONE.

In conclusione Rimangono ancora molti aspetti della criobiologia, soprattutto degli ovociti, che devono essere chiariti in modo da ottimizzare le tecniche. La crioconservazione di ovociti non può prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la maturazione in vitro.

In conclusione La cosa più importante è comunque porre la massima attenzione a che tutte le tappe dei procedimenti di congelamento e scongelamento siano effettuati con precisione e soprattutto alle giuste temperature.