Corso di laurea magistrale in Genetica e biologia molecolare nella ricerca di base e biomedica IL RUOLO DELLA PROTEINA FAK (FOCAL-ADHESION KINASE) DURANTE L’EPATOCARCINOGENESI Candidata: Ilaria Romito Matricola: Relatore Interno: Prof.ssa Patrizia Lavia Dipartimento: Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin“ Relatore Esterno: Dott.ssa Anna Alisi Ospedale Pediatrico Bambino Gesu’, Roma Anna accademico

IL CARCINOMA EPATOCELLULARE (HCC)  Quinto tumore più comune al mondo  Costituisce il 70-85% dei casi totali di tumore al fegato  Tasso di sopravvivenza estremamente ridotto, complessivamente del 3-5% Maggiori tassi di incidenza nei paesi asiatici e Africa sub-sahariana Figura riprodotta da Nordenstedt et al., 2010

SVILUPPO DELL’HCC: EPATOCARCINOGENESI Lo sviluppo dell’HCC è un processo multistep estremamente eterogeneo Negli ultimi anni è anche emerso il ruolo delle cancer stem cells (CSCs) come induttori del processo di epatocarcinogenesi Alterazioni delle principali funzionalità cellulari

TRATTAMENTO DELL’HCC La resezione epatica e il trapianto d’organo rappresentano ad oggi le uniche soluzioni terapeutiche possibili per l’HCC Resezione epatica rischio operatorio dell’1% e sopravvivenza dei pazienti dopo 5 anni dall’intervento del 50% Trapianto d’organo aumento fino al 70% del tasso di sopravvivenza dopo 5 anni dall’intervento SORAFENIB MULTI-INIBITORE DELLE TIROSINE-CHINASI

FAK (FOCAL ADHESION KINASE) E HCC Tessuti HCC: sovra-espressione di FAK, parallelo incremento del grado di invasività e metastatizzazione tumorale (Chen et al., 2010). mRNA di FAK in tessuti di pazienti HCCFAK in tessuti di pazienti HCC (IHC)

FAK è una tirosina- chinasi di 125 kDa FAK: IL GENE E LA PROTEINA Il gene PTK2 mappa sul cromosoma 8 Localizzazione: Adesioni focali Nucleo (Serrels et al., 2015 ) Sito di autofosforilazione

FAK rappresenta il principale mediatore delle vie di trasduzione del segnale integrine-mediate L’attivazione di FAK richiede la fosforilazione su diversi siti di tirosina FUNZIONI DI FAK

SCOPO DELLA TESI Studio dell’espressione di FAK in tessuti epatici di pazienti con HCC di diverso grado di malignità Studio in vitro dell’effetto del silenziamento di FAK sulla linea cellulare di HCC, HepG2 Definire il ruolo di FAK nell’epatocarcinogenesi

MODELLO SPERIMENTALE Modello in vitro Silenziamento stabile della proteina FAK mediante l’utilizzo di shRNAs in cellule HepG2 shCTRLshFAK Western BlottingIFRT-PCR Saggi Valutazione dell’effetto funzionale del silenziamento della proteina FAK

CREAZIONI DI CLONI CELLULARI DI HCC STABILMENTE SILENZIATI PER FAK Proteina FAK in cellule HepG2 shCTRL e shFAK. mRNA di FAK in cellule HepG2 shCTRL e shFAK. L’istogramma rappresenta la variazione media di almeno tre esperimenti +/- la deviazione standard (DS); ***p<0,001 rispetto alle cellule di controllo. Efficienza silenziamento: 50%-60% Efficienza silenziamento: 80%

CREAZIONI DI CLONI CELLULARI DI HCC STABILMENTE SILENZIATI PER FAK Analisi dell’espressione della proteina FAK totale per immunofluorescenza su cellule HepG2 silenziate e di controllo.

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULLA CRESCITA E PROLIFERAZIONE CELLULARE N° di cellule +/- la DS (almeno tre esperimenti); *p<0,05; **p<0,01 rispetto alle cellule di controllo. Riduzione del tasso di crescita cellulare (30%) (saggio di esclusione in Trypan blue) Riduzione del tasso di proliferazione (incorporazione BRDU nel DNA)

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULLE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE COINVOLTE NEL CONTROLLO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE Diminuita espressione delle forme totali e fosforilate di AKT e PTEN. La significatività statistica è stata calcolata con il test “t di Student”; **p<0,01; <0,001 rispetto alle cellule di controllo. WB Analisi densitometrica

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULLE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE COINVOLTE NEL CONTROLLO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE WB Analisi densitometrica La significatività statistica è stata calcolata con il test “t di Student”; * p<0,05; <0,001 rispetto alle cellule di controllo. Diminuita espressione delle forme totali e fosforilate di ERK1-2 e p38

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULL’INVASIONE E SULLA MIGRAZIONE CELLULARE Riduzione della capacità di invasione in soft Agar. N° di colonie +/- DS (almeno 3 esperimenti); ***p<0,001 rispetto alle cellule di controllo. Riduzione della capacità di migrazione delle cellule HepG2 shFAK rispetto al controllo

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULL’APOPTOSI CELLULARE Il saggio di colorazione con Annessina V mostra un aumento di apoptosi in cellule HepG2 silenziate per FAK. WB Proteina caspasi-3 Proteine p53-p21

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SULLA PROGRESSIONE CELLULARE **p<0,01 rispetto alle cellule di controllo. L’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare evidenzia che il silenziamento di FAK causa: una riduzione delle cellule nelle fasi G2 ed M un incrementato accumulo di cellule in una fase subG1, indicante apoptosi.

EFFETTI DEL SILENZIAMENTO DI FAK SUI GENI MARCATORI DI STAMINALITÀ ***p<0,001 rispetto alle cellule di controllo Il silenziamento di FAK provoca una diminuzione statisticamente significativa del livello di espressione del gene Nanog, del gene Oct-4 e del gene Gankyrin.

ESPRESSIONE DI FAK NEL FEGATO DI PAZIENTI CON HCC FAK totale negli epatociti aumenta nel tessuto di pazienti HCC parallelamente al grado del tumore. pFAK tyr397 aumenta a livello dei nuclei degli epatociti parallelamente all’aumento di PCNA. Tale incremento correla in maniera lineare con il grado di severità e con la presenza di metastasi.

RISULTATI I risultati ottenuti da questo lavorano indicano che:  Il silenziamento di FAK provoca una riduzione statisticamente significativa della capacità di proliferazione, invasione e migrazione all’interno di cellule di HCC umano HepG2, concomitante ad un’alterazione della progressione del ciclo cellulare e ad una aumentata apoptosi  Il silenziamento di FAK provoca un’importante riduzione dell’espressione di geni associati al pool di CSCs in cellule HepG2  L’espressione della proteina FAK aumenta parallelamente al grado di malignità dell’HCC, soprattutto in tessuti epatici di pazienti con un evidente processo di metastatizzazione

CONCLUSIONI In conclusione, i nostri dati mettono in evidenza il ruolo fondamentale di FAK come regolatore dell’omeostasi di cellule di HCC umano suggerendo che la de-regolazione dell’espressione e dell’attivazione di tale proteina, anche se parziale, potrebbe rappresentare la base per individuare nuove molecole ad uso terapeutico.

STEP SUCCESSIVO Validazione dei risultati ottenuti su altre linee di HCC, per poter confermare il ruolo anti-proliferativo e anti-tumorigenico del silenziamento di FAK Traslazione dei dati ottenuti in un modello animale per poter confermare il ruolo anti-tumorigenico dell’inibizione di FAK

RINGRAZIAMENTI Dott.ssa Anna Alisi Dott.ssa Daniela Gnani Dott.ssa Nadia Panera Dott.ssa Annalisa Crudele Dott. Cristiano De Stefanis Prof. Valerio Nobili Prof.ssa Patrizia Lavia GRAZIE PER L’ ATTENZIONE