Spettroscopia CD Luce polarizzata Polarimetro Sostanze Chirali Molecola Otticamente attive Birifrangenza Dicroismo Circolare

Modello classico ad onda sinusoidale Radiazione Elettromagnetica Modello classico ad onda sinusoidale La radiazione elettromagnetica è composta da onde elettromagnetiche, consistenti, cioè, nell'oscillazione concertata di un campo elettrico e di un campo magnetico. Queste onde si propagano in direzione ortogonale a quella di oscillazione

Luce emessa da una lampadina Luce monocromatica Laser

Il piano individuato dalla Polarizzazione Rispetto a un'onda acustica o a un'onda marina, l'onda elettromagnetica presenta un'ulteriore caratteristica: la polarizzazione. Il vettore campo elettrico (così come il vettore campo magnetico) di un'onda oscilla sempre nella stessa direzione. Il piano individuato dalla direzione di oscillazione del campo elettrico e dalla direzione di propagazione dell’onda è il suo piano di polarizzazione.

Polarizzazione •Il vettore campo elettrico E mantiene costante la sua direzione (perpendicolare alla direzione di propagazione). •L’ampiezza del vettore E varia in modo sinusoidale (nel tempo e lungo la direzione di propagazione). Convenzionalmente la direzione del vettore E è rappresentata con un segmento con doppia freccia

Radiazione non polarizzata Le sorgenti più comuni (sole, lampadine) emettono onde in cui il piano di polarizzazione è orientato in modo casuale attorno alla direzione di propagazione: la radiazione è non polarizzata.

Polarizzazione Lineare Se tutte le onde che costituiscono la radiazione hanno la stessa direzione di oscillazione del campo elettrico (stesso piano di polarizzazione), la radiazione è polarizzata linearmente.

Polarizzazione lineare Polarizzazione lineare lungo l’asse y Polarizzazione lineare lungo l’asse x In queste e nelle successive animazioni viene mostrato il solo campo elettrico; il campo magnetico è perpendicolare a quello elettrico e alla direzione di propagazione dell’onda

Polarizzatore

Polarizzatore Per spiegare come avviene la polarizzazione della luce si può fare il seguente esempio del cancello e grata metallica. scuotendo la corda per creare un’onda questa attraversa il cancello solo se l’onda giace su un piano parallelo alle inferriate del cancello. Per spiegare il fenomeno considerando la luce come un insieme di raggi rettilinei, ho proposto di pensare ai raggi della luce come ad un mazzo di spaghetti sparpagliati: se si lasciano cadere gli spaghetti sopra una rete a cavi paralleli, questa sarà attraversata solo dagli spaghetti che sono paralleli ai cavi

Polarizzatore Per spiegare come avviene la polarizzazione della luce si può fare il seguente esempio del cancello e grata metallica.

Polarizzatore

Polarizzatore La radiazione non polarizzata può essere resa polarizzata facendola passare attraverso un polarizzatore che lascia passare solo le componenti del campo elettrico che sono parallele all’asse del polarizzatore

Polarizzatore I filtri Polaroid sono materiali plastici costituiti da molecole allungate, allineate mediante stiramento Se la luce è polarizzata parallelamente alla direzione della molecola, essa viene totalmente assorbita dalla molecola. Se la luce è polarizzata perpendicolarmente alla direzione della molecola, essa viene totalmente trasmessa Per qualsiasi altra direzione di polarizzazione la luce è trasmessa, ma con intensità minore rispetto alla luce incidente.

Polarizzatore Sovrapponendo due filtri polarizzatori e facendoli ruotare l'uno rispetto all'altro si osserva un graduale oscuramento.

Polarizzatore

una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se è in grado di ruotare il piano della luce polarizzata affinché la sostanza sia otticamente attiva, le sue molecole devono presentare una asimmetria nella loro struttura, tale da ruotare il piano di polarizzazione della luce. In particolare le sostanze otticamente attive sono connesse ad una determinata proprietà delle molecole: la chiralità es. aminoacidi

una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se è in grado di ruotare il piano della luce polarizzata

polarimetro Quando un fascio di luce monocromatica linearmente polarizzata attraversa un campione di sostanza chirale, il piano di polarizzazione della luce uscente dal campione forma un angolo con quello della radiazione incidente. Tale angolo, misurato in gradi, (positivo o negativo a seconda che la rotazione sia avvenuta in senso orario, a destra, o in senso antiorario, a sinistra, rispetto ad un osservatore verso cui si propaga l'onda) viene detto ROTAZIONE OTTICA. Esso dipende dallo spessore attraversato e dalla quantità di materia ivi contenuta.

polarimetro

polarimetro La luce ordinaria (di solito una radiazione monocromatica del sodio) entra in un prisma polarizzante di Nicol (polarizzatore) e viene convertita in luce polarizzata, che passa attraverso un tubo contenente il campione per poi arrivare a un altro prisma di Nicol, detto analizzatore.

polarimetro All'interno del tubo portacampioni viene inserita una sostanza che può fare ruotare il piano della luce polarizzata ed essere quindi otticamente attiva(es. soluzione di acqua e zucchero, trementina, soluzioni di carboidrati, proteine e steroidi). Se la sostanza invece è otticamente inattiva (es. acqua, alcol), il piano della luce polarizzata resta invariato.

polarimetro Il prisma analizzatore può ruotare e quando è orientato a 90° rispetto al piano della luce polarizzata, la luce non passa e il campo visivo dell'osservatore risulterà nero. Con rotazioni intermedie tra 0° e 90° una certa frazione della luce sarà trasmessa sino all'occhio dell'osservatore e cioè quella frazione che corrisponde alla componente del vettore luminoso nel piano dell'analizzatore. Se il prisma analizzatore è orientato a 0° rispetto al piano della luce polarizzata si ha il massimo valore della luce trasmessa.

Potere Rotatorio Specifico λ= lunghezza d’onda (riga D del sodio, 598 nm) T = temperatura in °C α= angolo di rotazione osservata c = concentrazione del campione in g/mL l= lunghezza della cella (dm)

Potere Rotatorio Specifico

Polarizzazione Circolare l’estremo del vettore E , in un dato punto, descrive nel tempo una circonferenza. Si distingue tra polarizzazione circolare destrorsa o sinistrorsa a seconda che l’estremo del vettore E, visto da un osservatore verso cui si propaga l’onda, descriva nel tempo una circonferenza in senso orario o antiorario

Polarizzazione Circolare La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità. La combinazione delle due componenti circolarmente polarizzate in direzione opposta, quindi risulta in luce linearmente polarizzata che oscilla in un piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

Polarizzazione Circolare La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità. La combinazione delle due componenti circolarmente polarizzate in direzione opposta, quindi risulta in luce linearmente polarizzata che oscilla in un piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

Polarizzazione Circolare La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità Il vettore campo elettrico non cambia in modulo durante un periodo, ma varia in direzione, sempre restando perpendicolare alla direzione di propagazione. La sua proiezione su un piano perpendicolare alla direzione di propagazione è una circonferenza. Nel tempo il vettore descrive perciò un'elica destrogira o levogira.

una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se interagisce in modo diverso con luce polarizzata circolarmente a destra e a sinistra. La ROTAZIONE OTTICA deriva da una velocità diversa, e quindi da un indice di rifrazione diverso, per la propagazione di luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra (birifrangenza circolare). nL≠ nR

Polarizzazione Circolare eL ≠eR Nella regione di lunghezze d’onda in cui il campione assorbe, la diversa interazione della sostanza otticamente attiva con luce polarizzata circolarmente a destra o a sinistra può esplicarsi in un diverso assorbimento, cioè due coefficienti di assorbimento diversi per le due componenti di luce circolarmente polarizzata (a destra o a sinistra): l'intensità di una delle due componeneti viene ridotta maggiormente rispetto all'altra. Il risultato sarà che quando ricombinate, queste due componenti danno luogo a luce che non è più linearmente polarizzata (figura a), ma a luce ellitticamente polarizzata (figura b). Questo effetto viene chiamato Dicroismo Circolare.

Polarizzazione Circolare eL ≠eR l’estremo del vettore E, in un dato punto, descrive nel tempo una ellisse anche in questo caso si distingue tra polarizzazione ellittica destrorsa o sinistrorsa a seconda che l’estremo del vettore E, visto da un osservatore verso cui si propaga l’onda, descriva nel tempo una circonferenza in senso orario o antiorario

Polarizzazione Circolare L’animazione che segue mostra cosa accade ad un’onda polarizzata linearmente (celeste) quando attraversa un mezzo (ipotetico) che non assorbe affatto la componente circolare sinistra (in rosso), ma assorbe molto la componente destra (in verde) All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Polarizzazione

Spettropolarimetro CD La radiazione monocromatica viene polarizzata linearmente e passa poi attraverso un modulatore fotoelastico che genera alternativamente luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra con una certa frequenza di modulazione. La radiazione così modulata passa attraverso il campione e rivelata dal fotomoltiplicatore. Il segnale risultante, anch’esso modulato alla stessa frequenza, fornisce la differenza di assorbanza delle due componenti polarizzate circolarmente, a quella lunghezza d’onda. Variando la lunghezza d’onda si ottiene lo spettro CD.

Il dicroismo circolare ha luogo solo nelle regioni dello spettro in cui il campione assorbe La birifrangenza circolare ha luogo in tutte le regioni di lunghezze d’onda di una sostanza otticamente attiva. Le regioni di frequenze esplorate per CD possono essere diverse, tuttavia il caso più comune è quello dell’UV–visibile (transizioni elettroniche). Uno spettro CD, come quello di assorbimento isotropo, risulta costituito quindi da bande. Una banda CD, ben separata dalle altre, assomiglia strettamente alla corrispondente banda isotropa, ma, diversamente da questa, poiché si tratta di una differenza di assorbimento, può essere sia positiva sia negativa (a seconda che eL sia maggiore o minore di eR).

Applicazioni CD in biologia Folding/unfolding di proteine Ligand binding (costanti di legame) Variazioni strutturali indotte per es da pH, solvente, temperatura Aspetti strutturali di acidi nucleici,polisaccaridi, ormoni, peptidi Termodinamica degli acidi nucleici

Applicazioni CD in biologia

CD di acidi nucleici I cromofori responsabili dell’assorbimento nel vicino UV sono le basi puriniche e pirimidiniche. Le basi stesse sono intrinsecamente simmetriche, e quindi otticamente inattive. Nei nucleotidi, tuttavia, esse acquisiscono una assimmetria configurazionale indotta dagli zuccheri chirali ribosio e desossiribosio, a cui sono legate, che rende le bande dicroiche.

Si può osservare nettamente che CD di acidi nucleici DNA: una banda positiva a circa 275 nm e una negativa a 240 nm. Le bande sono molto più intense di quelle della miscela di monomeri alla stessa composizione. RNA: una banda positiva a circa 260 nm ed una banda negativa a 210 nm. Si può osservare nettamente che il contributo fondamentale, in entrambi i polimeri, è dovuto principalmente dalla struttura secondaria, che determina interazioni particolari tra i cromofori. Gli spettri CD sono quindi un metodo molto sensibile alla struttura secondaria di queste macromolecole, e alle sue variazioni con solvente, temperatura, forza ionica, …

CD di acidi nucleici Lo scheletro lineare del DNA si avvolge su se stesso per formare una struttura elicoidale destrorsa o sinistrorsa. Si distinguono, essenzialmente, due forme di DNA destrorso, denominate forma A e forma B, e una forma sinistrorsa, detta Z Le maggiori differenze consistono nella geometria dei legami, nel numero di basi necessarie per un giro d’elica, per l’angolo di inclinazione di zuccheri e basi rispetto all’asse.

La forma B `e quella maggiormente favorita in condizioni di alta umidità relativa (maggiore del 75%), e quindi la forma predominante in soluzioni acquose. La forma A invece si presenta come un filamento corto e spesso con diametro di 25.5 ˚A, in cui le basi sono inclinate di circa 19o rispetto all’asse principale e giacciono su un piano ruotato di circa 30o rispetto al piano ortogonale all’asse stesso. La forma Z del DNA invece, ha avvolgimento sinistrorso dovuto a una diversa disposizione relativa di zucchero e basi azotate nello spazio: la struttura che la caratterizza ha un aspetto esteriore ben diverso dalle eliche destrorse poichè l’ossatura fosforo-zucchero si snoda a zig-zag lungo l’asse principale e proprio per tale motivo viene denominata Z.

CD di acidi nucleici A B Z forma B (…) : un doppietto positivo – negativo a circa 280 e 240 nm e una intensa banda positiva a 190 nm. B forma A (- - -) : una banda positiva a 270 nm, più intensa delle forme precedenti, accoppiata ad una banda negativa a 210 nm e a quella positiva, estremamente intensa, a 185 nm. A forma Z (-) (elica sinistrorsa): una banda negativa a 290 e una positiva a 260 (cioè un doppietto di segno opposto a quello della forma B), una banda negativa a 195 nm ed una ancora più intensa positiva a 180 nm. La proposta originaria è stata poi dimostrata dall’analisi strutturale ai raggi i X. Z

interazione con piccole molecole CD di acidi nucleici: interazione con piccole molecole

CD di Proteine

CD di Proteine (ca 200-250 nm) Gli aminoacidi sono asimmetrici e sono sempre otticamente attivi La struttura SECONDARIA di una proteina può essere determinata mediante spettroscopia CD nella regione dell’UV-lontano (190-250 nm). Questa regione è dominata dall’assorbimento del legame petidico Spettro CD della poli-lisina

CD di Proteine (ca 200-250 nm)

CD di Proteine (UV lontano) Lo spettro CD di una proteina nel lontano UV può essere sensibile a certi aspetti della struttura terziaria A queste lunghezze d’onda i cromofori sono gli amino acidi aromatici e i legami disolfuro. I segnali CD nel lontano UV sono circa nulli, se una proteina conserva la sua struttura secondaria ma non mantiene una struttura terziaria ben definita. Se invece compaiono dei segnali in questa regione spettrale vi è chiara indicazione che la proteina possiede una struttura tridimensionale definita. Lo spettro CD nel lontano UV è anche sensibile a piccole modificazioni della struttura terziaria dovute ed interazioni proteina-proteina.

Emoglobina Deossiemoglobina (alto spin) Ossiemoglobina (basso spin)

Emoglobina Deossiemoglobina (alto spin) Ossiemoglobina (basso spin)

Studio della denaturazione CD di Proteine: Studio della denaturazione Le proteine possono essere denaturate in vari modi: variando la temperatura, variando il pH fino a condizioni estreme, utilizzando denaturanti chimici. Gli organismi termofili sono caratterizzati da una temperatura di crescita ottimale compresa tra 50 e 80°C Per gli organismi ipertermofili tale temperatura è compresa tra 80 e 120°C. L’identificazione dei principi di adattamento delle proteine alle alte temperature è indispensabile per chiarire il meccanismo del folding e le relazioni funzione-struttura.

Studio della denaturazione CD di Proteine: Studio della denaturazione Lo spettro della proteina nativa a 20°C mostra una banda negativa con un minimo profondo tra i 210 e 220 nm e un’intensa banda positiva tra i 190 e i 195 nm. Queste caratteristiche sono tipiche di proteine contenenti molti elementi di struttura secondaria quali a-eliche e foglietti b. Lo spettro CD dell’enzima a 108°C mostra un minimo meno profondo tra i 210 e220 nm, tuttavia, la struttura della proteina è ancora parzialmente conservata. Questo mostra che la SsoPox è una proteina estremamente resisitente alla tempratura, come è lecito aspettarsi essendo una proteina proveniente da un batterio ipertermofilo.

Riassumendo Da un’analisi CD possiamo ottenere informazioni sulla struttura tridimensionale di macromolecole otticamente attive come DNA e proteine. Per farlo si utilizza lo spettropolarimetro, uno strumento in grado di misurare l'ellitticità generata da un campione al variare della lunghezza d'onda del raggio incidente (siamo nel campo degli UV), ottenendo così lo spettro CD di quel campione. Ogni struttura secondaria delle proteine ha un suo spettro caratteristico dovuto alla disposizione spaziale dei legami peptidici. Confrontando questi spettri con quello di una proteina qualsiasi è possibile ricavare il tipo di strutture secondarie di quella proteina e in che misura sono presenti. Con la spettroscopia di dicroismo circolare non possiamo sapere quali sono, ad esempio, gli aminoacidi coinvolti in tali strutture (per queste informazioni bisogna ricorrere alla più complessa spettroscopia NMR (o EPR) e alla cristallografia con i raggi X) però permette in modo rapido di ottenere informazioni come la stabilità della struttura di una proteina al variare della temperatura o dell'intorno chimico in cui si trova.

Il citoctomo b562 è una piccola proteina solubile (12 Il citoctomo b562 è una piccola proteina solubile (12.3 kilodaltons) isolata dalla Escherichia coli che contiene un gruppo prospettico eme di tipo b. Al’epoca dell’articolo si ipotizzava che la funzione di questa proteina fosse quella di trasportare elettroni anche se non di aveva alcune conoscenza dei possibili partners. Il citoctomo b562 presetza una struttura semplice (quattro eliche impachettate circa antiparallelamente le une rispetto alle altre con il gruppo eme posizionato ad uan estremità della struttura) che la rende un buon modello per studiare la stabilità ed il ripiegamento delle proteine. Studi sulle apomioglobine, apoemoglobine e apocitocromi avevano all’epoca suggerito che la stabilità e la struttura di queste proteine dipendesse fortemente dalla presenza del gruppo eme. Lo scopo del presente lavoro era stato quello di approfondire le conoscenze sul ruolo del gruppo eme nella integrità ed il ripiegamento delle proteine

Materiali: Ferrocitocromo b562 Ferricitocromo b562 Apocitocromo b562 Tecniche sperimentali: spettroscopia UV Spettroscopia CD Cromatografia (HPLC)

Ferrocitocromo b562 Ferricitocromo b562 Apocitocromo b562

Struttura secondaria Ferrocitocromo b562 Ferricitocromo b562 Apocitocromo b562 Tutti e tre gli spettri mostrano un picco negativo a 222 nm che indica un alto contenuto di struttura ad elica . L’effetto è meno marcato per l’apoproteina, suggerendo una minore quantità di struttura ad elica rispetto alla ferri e ferro proteina

Denaturazione acida Ferricitocromo b562 Apocitocromo b562 pH 2.9 pH 2.3 La denaturazione delle proteine a bassi pH è dovuta alla repulsione tra cariche

Energia libera di stabilizzazione e stabilità termica

DG = 3.4 kcal/mol apocitocromo DG = 6.6 kcal/mol ferricitocromo Tm= 52.3 °C apocitocromo Tm= 67.2 °C ferricitocromo La stabilità dell’apoproteina è ridotta dalla’assenza del gruppo eme

I risultati del’analisi cromatografica di esclusione molecolare indicato che l’apoporoteina presenta una struttura molecolare più estesa del ferricitocromo