Effetto combinato di agonisti del recettore muscarinico M2 FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI  Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche   Effetto combinato di agonisti del recettore muscarinico M2 e farmaci chemioterapici convenzionali in linee tumorali   Relatore: Prof.ssa Ada Maria Tata Candidato: Ludovica Spagnuolo Anno accademico 2014-2015

ACETILCOLINA E TUMORI L’espressione e l’attivazione dei mAChRs è in grado di regolare, in diverse linee cellulari tumorali, la proliferazione, la migrazione e l’angiogenesi Acetilcolina: neurotrasmettitore del sistema nervoso centrale (SNC) e periferico (SNP)

RECETTORI COLINERGICI MUSCARINICI I recettori muscarinici risultano espressi in molti tumori primari e metastatici, in particolare M2: Tumore alla vescica Tumore alla mammella Neuroblastoma Glioblastoma

ESPRESSIONE DEL RECETTORE MUSCARINICO M2 Glioblastoma Tumore alla mammella M1 M2 M3 M4 M5 M2 M3 18S- -250 bp -84 bp hBrain -150 bp Caratterizzazione del recettore muscarinico M2 nelle U251 MG Caratterizzazione dei recettori muscarinici nelle MDA-MB-231 Effetto inibitorio dell’arecaidina sulla proliferazione e la sopravvivenza in entrambe le linee cellulari

TUMORE ALLA MAMMELLA Farmaco antitumorale Caratteristiche del tumore Antracicline Taxani: Paclitaxel (o taxol) Caratteristiche del tumore Altamente eterogeneo Sorprendente diversità fenotipica: Terapia corrente Resezione chirurgica Radioterapia Chemioterapia - gruppo luminale A/B Ormonoterapia Uso di anticorpi monoclonali - gruppo basal-like - gruppo HER2

GLIOBLASTOMA MULTIFORME Caratteristiche del glioblastoma Astrocitoma di IV grado Forma tumorale aggressiva Prognosi severa GM primario e secondario Terapia corrente Asportazione chirurgica Radioterapia Chemioterapia Farmaco antitumorale Temozolomide

CHEMIO-RESISTENZA Over-espressione delle pompe di efflusso ai farmaci Meccanismi di chemio-resistenza intrinseci Cellule staminali tumorali Alterazione dei mi-RNAs Mutazione delle proteine di riparo

OBIETTIVI DELLA RICERCA Individuare le concentrazioni sub-tossiche dei farmaci antitumorali, la temozolomide e il paclitaxel rispettivamente nelle linee cellulari U251MG e MDA-MB-231 Combinare ognuno dei due farmaci con l’agonista M2 usato a concentrazioni sub-tossiche Valutare la modulazione dell’espressione delle pompe da efflusso ai farmaci, in seguito al trattamento combinato

Cellule di glioblastoma Cellule tumorali della ghiandola SCHEMA SPERIMENTALE Linee cellulari Cellule di glioblastoma multiforme U251 Cellule tumorali della ghiandola mammaria MDA-MB-231 Tecniche utilizzate: Saggio di vitalità cellulare Analisi per RT-PCR e Western Blot

EFFETTO DEI FARMACI SULLA CRESCITA CELLULARE LINEA CELLULARE: MDA-MB-231

Effetti sulla crescita cellulare nelle MDA-MB-231 a 48h RISULTATI: COTRATTAMENTO ARECAIDINA-PACLITAXEL Effetti sulla crescita cellulare nelle MDA-MB-231 a 48h

EFFETTI DELL’ARECAIDINA SULLA CRESCITA CELLULARE Concentrazioni sub-tossiche di arecaidina nella linea cellulare U251 MG a 48h

EFFETTI DELLA TEMOZOLOMIDE SULLA CRESCITA CELLULARE Concentrazioni sub-tossiche del farmaco antitumorale nella linea cellulare U251MG

Effetti sulla crescita cellulare nelle U251 MG a 48h RISULTATI: COTRATTAMENTO ARECAIDINA-TEMOZOLOMIDE Effetti sulla crescita cellulare nelle U251 MG a 48h

CONSIDERAZIONI L’effetto combinato determina una diminuzione della crescita cellulare Questo consente di ridurre gli effetti tossici sull’intero organismo Cosa succede alle pompe da efflusso in seguito al co-trattamento?

RISULTATI - ESPRESSIONE DELLA POMPA ABC G2 -203 bp 18S- -84 bp Ctrl Are Px Are 12.5µM+ 12.5µM 10-9M Px10-9M

RISULTATI - ESPRESSIONE DELLA POMPA ABC B1 294 bp DMSO Are TMZ Are 6,25 m M+ 6,25 M 3 M TMZ 3 abcb1 18S 84 1 2 4 DMSO Are TMZ Are 6,25 M 3 M TMZ 3 mRNA abc b1/18S (O.D. arbitrary units)

CONSIDERAZIONI Il trattamento combinato è in grado di ridurre significativamente l’espressione delle pompe da efflusso La diminuzione della farmacoresistenza, causata da una ridotta espressione delle pompe di efflusso MDR, determina l’incapacità da parte della cellula di estrudere i farmaci

CONCLUSIONI L’utilizzo combinato dei farmaci a basso dosaggio pone l’attenzione su un nuovo interessante approccio terapeutico nella terapia anti-tumorale, che potrebbe vedere potenziare gli effetti dei farmaci chemioterapici diminuendo gli effetti collaterali che questi hanno sull’intero organismo.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE!