Il controllo delle malattie I vari metodi di controllo possono essere classificati come Regolatori tendono ad escludere un patogeno dall’ospite o da una determinata area geografica Culturali Cercano di evitare il contatto tra pianta e patogeno creando delle condizioni ambientali sfavorevoli al patogeno. Eliminando o riducendo la quantita di patogeno su di una pianta, in un campo, in un’area Biologici Aumentano la resistenza dell’ospite favorendo la presenza di microrganismi antagonisti del patogeno Un nuovo tipo di controllo biologico viene fatto mediante la tecnica del DNA ricombinante e quindi l’uso di piante transgeniche Fisici & Chimici Prevenendo l’arrivo del patogeno o curando l’infezione in atto Miglioramento genetico

Targets for Improvement I bersagli per il miglioramento ricadono in 3 categorie Stress di natura biotica- (pests and diseases)‏ Piante parassite, Funghi (e.g. Blast), Batteri (e.g. Blight), Virus (e.g. Rice yellow mottle virus), Insetti (e.g. Brown plant hopper), Nematodi (e.g. Cyst-knot nematode)‏ Stress di natura abiotica (adverse physical environment)‏ Umidità, disponibilità di nutrienti, Salinità, Freddo, Allagamenti Produttività e qualità Morfologia, Efficienza fotosintetica, fissazione dell’azoto, ripartizione del carbonio, aroma

Selezione assistita da marcatori nella resistenza alle malattie I geni di resistenza possono essere selezionati attraverso uno screening in presenza della malattia. Quindi il breeding convenzionale può produrre varietà resistenti Ma i geni non conferiscono una resistenza eterna. I patogeni mutano e in 2-3 anni diventano resistenti a loro volta Se ci sono molti geni di resistenza, il patogeno impiegherebbe molto tempo per riuscire a scavalcare le difese (in pratcia ciò non avviene mai)‏ Ma è impossibile selezionare ad es. 3 geni attraverso il breeding convenzionale, in pratica è impossibile predire la differenza tra 1, 2 o 3 geni solo attraverso il fenotipo Ma se si selezionano dei marcatori collegati (linked) a dei geni di resistenza, si possono introdurre molteplici geni di resistenza

QTL - Quantitative Trait Loci Un quantitative trait locus è la posizione in cui si trova un gene (o più geni) che influenzano un tratto continuo. Esempi di tratti quantitativi sono ad es. L’altezza di una pianta, la produttività etc. Questi tratti sono influenzati normalmente da più di un gene e anche dall’ambiente. Quindi, mappare i QTL sul genoma è più complesso che mappare un singolo gene che influenza un tratto qualitativo (ad esempio il colore)‏

QTL Mapping I QTL sono identificati sulla base di un’associazione statistica tra la segregazione di un tratto fenotipico e la segregazione dei marcatori genetici In linea di principio può essere utilizzata ogni classe di marcatori, ma i moderni programmi di breeding sono condotti esclusivamente su mappe costruite con DNA markers (RFLP, AFLP, SSR, SNP) perché: Ottimizzano la copertura dell’intero genoma Sono ripetibili Sono efficienti

QTL Mapping Per scoprire il legame QTL/marker, è necessario avere una popolazione segregante (cioé sperimentale) in cui la distribuzione dei marker e l’espressione (fenotipo) del tratto d’interesse può essere facilmente riconosciuta Le piante parentali (usate per il breeding) devono essere geneticamente vicine (cultivars o specie) ma differire quanto più possibile nell’espressione del tratto che deve essere mappato Nelle piante le popolazioni sperimentali che risultano dagli incroci di parentali che sono un ibrido ricombinante (RI) o da un doppio aploide (DH) sono quelle che forniscono maggiori informazioni

QTL Mapping All’interno di questa popolazione sperimentale, il pattern di segregazione di un grande numero di marker può essere rintracciato, dato che corrisponde alla segregazione dei tratti fenotipici di interesse Una volta che un insieme di marker genomici è stata valutata e le regioni di potenziale interesse definite, un’alta densità di marker può essere analizzata all’interno di queste regioni

QTL contro la fusariosi Resistance to FHB in some cultivated wheat cultivars is derived from the Chinese cv. Sumai 3 and its derivatives. Sumai 3-derived resistance to FHB is a complex, quantitative trait which confers type II resistance (HR) that limits fungal spread from the site of infection (Bai and Shaner 2004). Nel QTL di Sumai-3 è presente un gene codificante per una UDP-glucosil transferasi che converte il DON nella sua forma meno fitotossica 3-glucosil-DON

Vantaggi e svantaggi nel breeding della resistenza verticale La resistenza può essere ottenuta incorporando uno, pochi o molti geni di resistenza in una varietà. Alcuni di questi geni possono controllare alcuni importanti steps nello sviluppo della malattia e quindi svolgono un ruolo importante nella resistenza La resistenza verticale È utile contro specifici patogeni o specifiche razze di patogeno È maggiormente efficace quando È incorporata in specie annuali, facile da migliorare come I cereali È diretta contro patogeni che non si riproducono e diffondono rapidamente come Fusarium o contro patogeni che non mutano frequentemente come Puccinia Consistono di geni R “forti” che conferiscono una resistenza completa e a lungo termine La popolazione ospite non consiste di una varieta uniforme geneticamente Se una sola di queste condizioni non si verifica la resistenza diventa di breve durata e compaiono nuove razze di patogeno che bypassano le difese dell’ospite

…e orizzontale La resistenza orizzontale Conferisce una resistenza parziale ma di più lunga durata Tale resistenza coinvolge piu processi fisiologici dell’ospite che agiscono come meccansimi di difesa e che sono degli ostacoli impossibili da superare per il patogeno Le piante con la resistenza orizzontale rimangono resistenti piu a lungo ma con minore intensita’

Multilinee e piramidalizzazione Le varietà con la resistenza verticale sono spesso attaccate all’improvviso da nuove razze di patogeno e questo può portare a delle vere e proprie epidemie Per evitare questo svantaggio, cioè l’inefficienza della resistenza affidata a pochi geni, vengono oggi usate le multilinee attraverso la piramidalizzazione Le multilinee sono una miscela di varietà individuali (linee e cultivar) che sono agronomicamente simili ma che differiscono nei loro geni di resistenza La piramidalizzazione consiste nell’uso di varietà che sono derivate dall’incrocio di molte varietà che contengono geni R diversi e poi selezionando da queste solo quelle che contengono una miscela di tutti i geni R Le multilinee e la piramidalizzazione sono stati sviluppate come metodiche soprattutto nella lotta contro le ruggini dei cereali, ma il loro uso sta decisamente aumentando anche in altri sistemi pianta-patogeno

Controllo mediante l’uso di piante transgeniche Piante transgeniche che tollerano gli stress abiotici Mannitol phosphodehydrogenase Piante transgeniche trasformate con specifici geni R Xa21 PR5K Piante transgeniche trasformate con geni che codificano per prodotti antipatogenici Chitinases Glucanases Piante transgeniche trasformate con acidi nucleici che portano alla resistenza e al silenziamento di geni del patogeno Coat protein Rnase Piante transgeniche trasformate con combinazioni di geni R Piante transgeniche che producono anticorpi contro patogeni Fab fragment - virus

Vantaggi e svantaggi dell’ingegneria genetica La manipolazione genetica può essere realizzata su cellule vegetali in coltura da cui in seguito possono essere rigenerate intere piante Molte piante però sono poliploidi (presenza nella cellula di molte copie del genoma) e questo può contribuire al fenomeno della variabilità somaclonale…in altre parole le piante rigenerate da singole cellule non sono geneticamente omogenee

Il controllo degli stress mediante l’ingegneria genetica Al fine di attuare nuove strategie di controllo delle malattie sono attualmente disponibili interessanti opportunità che si basano sull’uso di geni: R isolati da piante resistenti Avr isolati dai patogeni ulteriori geni vegetali richiesti per la resistenza alle malattie

Trasformazione di piante suscettibili con geni R Il miglioramento genetico tradizionale di specie ad interesse agronomico utilizza lunghi programmi di introgressione di nuovi geni R provenienti da specie selvatiche Le tecniche di trasformazione danno la possibilità di trasferire i singoli geni R in tali specie in una sola generazione Si ha inoltre la possibilità di introdurre simultaneamente numerosi alleli di geni R ognuno dei quali è efficace contro una singola specie patogena

Questo potrebbe rallentare il processo evolutivo dei patogeni dato che questi dovrebbero mutare contemporaneamente i diversi geni Avr corrispondenti ai geni R inseriti L’introduzione di geni R mediante la trasformazione rimuove le barriere dovute all’infertilità interspecifica Quindi aumenta il numero di specie vegetali a cui poter attingere come fonte di geni R

I geni R che danno resistenza a quasi tutte le razze di una particolare specie patogena (Xa21) del riso (Xanthomonas campestris) sono candidati interessanti per il trasferimento interspecifico per ottenere una resistenza a largo spettro L’alto grado di omologia (presenza di un dominio LRR) mostrato da molti geni R razza specifici può consentire un loro facile isolamento da specie eterologhe SVANTAGGI: l’estrema specificità di azione verso un singolo gene Avr di una determinata specie microbica

Creazione di nuovi geni R Una volta identificati i domini delle proteine R coinvolti nel riconoscimento si possono alterare le loro seq. AA in modo che essi riconoscano un maggior gruppo di prodotti microbici La struttura delle proteine R potrebbe essere alterata in modo da assumere una configurazione “attiva” e la proteina così modificata azionerebbe i meccanismi di difesa anche senza la percezione dei geni R SVANTAGGI: il mantenimento di queste difese costitutive potrebbe avere un elevato costo metabolico e quindi portare una perdita di resa nei raccolti (Rp1-mais)‏

Una combinazione di geni R e Avr clonati può indurre una HR Mediante l’espressione combinata di un gene R e del suo corrispondente gene Avr in un singolo genotipo è possibile attuare un innesco dell’HR L’espressione di uno dei componenti deve essere strettamente regolata altrimenti l’HR indotta risulta devastante non solo per il patogeno ma anche per la pianta Il fenotipo resistente può essere ottenuto usando un promotore inducibile da patogeno oppure attraverso una tecnica nota come GEAR (genetic engineer acquired resistance)‏

Sovraespressione e silenziamento possono aumentare la difesa Alcuni geni come prf e npr1 se espressi sotto un promotore forte (CaMV 35S) aumentano la resistenza a numerosi patogeni suggerendo che nelle piante wt queste proteine siano presenti in basse quantità La produzione di resveratrolo (fitoalessina della vite) in tabacco transgenico per la stilbene sintasi ha aumentato la resistenza a B. cinerea La coespressione di una chitinasi basica e di una glucanasi ha fornito un maggiore controllo di Cercospora nicotianae in tabacco

La produzione controllata di molecole segnale favorisce l’instaurarsi della difesa Lo scopo è quello di produrre piante che producano costitutivamente o sotto induzione una molecola segnale con il ruolo chiave nella difesa L’aumento di produzione di H2O2 tramite l’espressione di una glucosio ossidasi etereloga aumenta la resistenza delle piante a P. infestans e al batterio E. carotovora Accoppiando il promotore di un gene di risposta con quello di un gene di trasmissione del segnale si stabilisce una retroazione positiva per aumentare la velocità della risposta ad un patogeno in un genotipo normalmente suscettibile

Il silenziamento genico È un meccanismo attraverso il quale la pianta riesce ad inibire – a silenziare – l’attivazione dei geni virali Gli acidi nucleici transgenici possono essere progettati in modo da agire come molecole trappola che competono con il genoma virale infettante promuovendo le interazioni di proteine codificate dall’ospite o dai virus con elementi associati non adatti che non permettono la replicazione virale e la sua diffusione nella pianta Questo tipo di inibizione competitiva – silenziamento genico post trascrizionale (PTGS) – è stato già dimostrato in casi in cui il transgene codifica per una molecola di RNA o di DNA difettiva (e perciò interferente)‏

PTGS - 1 La produzione di RNA aberranti (aRNA) funziona da segnale di attivazione del meccanismo di silenziamento In seguito all’ingresso dei virus nella cellula vengono liberate copie di ssDNA virale (1) può avvenire l’appaiamento diretto tra DNA virale e transgene trappola (2), determinando la formazione di ssRNA aberranti (3). In alternativa trascritti derivanti dal transgene antisenso ibridizzano con mRNA virale (senso) determinando la formazione di dsRNA aberrante Se questi si accumulano al di sopra di un valore soglia (4) si attiva il silenziamento genico 1 35S transg Appaiamento diretto 2 trascrizione 3 ssDNA ssRNA ab. RNA virale . 4 Accumulo di dsRNA aberrante

PTGS - 2 CH3 Le molecole di aRNA possono attivare le metilasi (5) che abbassano l’espressione del transgene (6) oppure possono attivare RNA polimerasi RNA- dipendenti codificati dall’ospite (RDRP) (7) che producono copie di RNA che sono complementari ai trascritti virali (cRNA)‏ 1 35S transg Attivazione di metilasi trascrizione 6 5 Ss o dsRNA ab. RNA ab. Attivazione di RDRP dell’ospite 7 . . . Accumulo di cRNA

PTGS - 3 Gli RDRP utilizzano molecole di aRNA come stampi per produrre copie di RNA (8) che sono complementari ai trascritti e si legano a questi e a quelli del transgene determinando l’accumulo di RNA che ibridizzano con le sequenze silenziate Questo abbassa la produzione dei prodotti genici virali anche quando la velocità di trascrizione è alta (9)‏ I cRNA o i dsRNA possono anche muoversi sistemicamente in tutta la pianta inducendo il meccanismo di silenziamento in tutte le cellule dell’ospite Alcuni virus tuttavia producono proteine antisilenziamento come la proteina HC-Pro dei potyvirus Complesso RDRP RNA ab. RDRP 8 cRNA . . . 9 Degr. RNA 10 Diffusione sistemica di cRNA

Piante resistenti ai virus I virus delle piante sono un problema serio per molte delle più importanti colture agricole Gli effetti di una infezione virale sono Riduzione del tasso di crescita Riduzione del raccolto Qualità peggiore del raccolto Un accorgimento genetico standard, detto protezione crociata, consiste nell’infettare una pianta con un ceppo ipovirulento del virus.

Piante che esprimono geni virali Una particolare proteina del virus potrebbe essere responsabile dell’effetto protettivo Virus del mosaico del tabacco (TMV)‏ Per trasferimento genico mediato da Agrobacterium sono state prodotte piante transgeniche che esprimevano la coat protein del virus Le piante cp sono state esposte al TMV manifestavano maggiore resistenza

Pianta transgenica tmv

Piante resistenti ad insetti A causa degli insetti gli agricoltori perdono miliardi di raccolto L’arma migliore contro gli insetti sono gli insetticidi chimici….dannosi per l’ambiente Esistono pesticidi microbici naturali come il Bacillus thuringiensis…che in seguito a sporulazione produce una proteina tossica per le larve di alcuni insetti

La Bt toxin La tossina agisce legandosi a dei recettori presenti sulla superficie delle cellule dell’intestino medio bloccandone il funzionamento Le piante di tabacco e pomodoro che esprimono la Bt erano in grado di uccidere le larve di alcuni bruchi Attualmente il mais Bt è la prima varietà al mondo di mais coltivata!

Piante che esprimono inibitori di proteasi Quando un insetto sugge la linfa direttamente dal floema della pianta utilizza le proteasi seriniche per trarne nutrimento Sono state create delle piante transgeniche resistenti ad insetti attraverso l’espressione di inibitori della serina proteasi