Gli esperimenti di Luigi Galvani (1791) sul muscolo sartorio di rana Alla fine del ‘700, Luigi Galvani (fisiologo e anatomico dell’Università di Bologna) utilizzando zampe di rana isolate in modo da preservare la funzionalità nervo-muscolo, forniva le prime evidenze che il movimento muscolare avveniva grazie a “forze elettriche” di origine biologica. Queste “forze elettriche” potevano essere generate ogni qualvolta una coppia di metalli (rame-zinco) metteva in contatto i nervi esposti dei muscoli sartori con il liquido esterno. La contrazione avveniva anche quando le zampe di rana venivano stimolate direttamente con la corrente elettrica derivata dalla scarica di un fulmine o toccando i terminali di una bottiglia di Leida che fungeva da generatore elettrico. Mentre non vi era nulla da obiettare sull’esistenza del fenomeno e sull’impressionante riproducibilità degli esperimenti di Galvani, nacque in quel tempo una lunga ed aspra disputa sulle origini di queste forze a livello accademico, in particolare con Alessandro Volta, noto fisico dell’Università di Pavia. Galvani sosteneva che le forze erano di pura origine biologica e l’arco voltaico serviva unicamente a metterle in evidenza. Volta invece sosteneva che le forze elettriche erano di natura fisica, in quanto la coppia di metalli utilizzata da Galvani per gli esperimenti generava un potenziale elettrico di 1-2 Volts (pila voltaica) e quindi era in grado di trasmettere corrente al tessuto animale che possedeva caratteristiche conduttive passive. Volta sosteneva pertanto che il tessuto animale non era in grado da solo di generare alcuna forza elettrica e quindi le origini del movimento muscolare dovevano essere diverse. Galvani aveva ovviamente ragione anche se non era riuscito a dimostrare che la forze elettriche e la contrazione muscolare potevano avvenire senza l’intervento diretto della pila voltaica. Infatti, oggi noi sappiamo che i tessuti eccitabili (neuroni, muscoli, ghiandole endocrine) producono spontaneamente potenziali elettrici le cui variazioni inducono eccitamento e quindi contrazione. L’esperimento cruciale che convinse tutti dell’esistenza di “forze bioelettriche” di pura origine biologica fu condotto da Carlo Matteucci nel 1840 ed è illustrato nella successiva diapositiva. De Viribus Electricitatis in motu muscularis Le Forze Elettriche nel movimento muscolare Eccitabilità_1

L’esperimento di Matteucci (1840) Stimolazione del nervo al contatto di metalli diversi La zona lesionata del muscolo 1 è importante per generare una corrente locale tra la zona sana e quella lesa quando il muscolo si eccita. Durante l’eccitazione e la contrazione del muscolo 1, tra le due zone si genera una differenza di potenziale sufficiente per generare un potenziale d’azione nel neurone del muscolo 2, posto in stretto contatto con le due zone. In questo esperimento, il secondo muscolo si contrae senza essere stato in contatto con alcun elemento metallico, dimostrando in maniera univoca l’esistenza di correnti elettriche di eccitazione di pura origine fisiologica. Eccitabilità_1

COME SI ORIGINA E COME SI MISURA IL POTENZIALE DI MEMBRANA DI UNA CELLULA ECCITABILE A RIPOSO? Eccitabilità_1

MISURA DEL POTENZIALE DI MEMBRANA (Vm) DI UNA CELLULA ECCITABILE Vm si misura con due elettrodi collegati ad un oscilloscopio: un microelettrodo di vetro molto sottile riempito di soluzione salina KCl e contenente un filo di argento clorurato, in contatto con l’amplificatore (elettrodo interno). un elettrodo metallico di Ag-AgCl immerso nel liquido extracellulare (elettrodo esterno). 1o caso - Il microelettrodo è fuori dalla cellula Eccitabilità_1

PROPRIETÀ DEL POTENZIALE DI MEMBRANA A RIPOSO: 2o caso - Il microelettrodo penetra la cellula Vm = Vi – Ve per convenzione Ve= 0 PROPRIETÀ DEL POTENZIALE DI MEMBRANA A RIPOSO: il potenziale di membrana a riposo (Vm) delle cellule animali è negativo e varia tra –40 e –100 mV Vm non varia se la pipetta penetra più profondamente nell’interno della cellula (potenziale uniforme) la differenza di potenziale costituisce una sorgente energetica Nota importante: esiste un campo elettrico molto elevato ai capi della membrana. Calcoliamolo: E = V/d V= -70 x 10-3 (Volt) d= 5 x 10-9 (m) E = 70/5 x 106 (V/m)  107 (V/m) Eccitabilità_1

CHI GENERA IL POTENZIALE DI MEMBRANA? In una cellula permeabile ad un solo ione: il potenziale di membrana coincide con il potenziale di equilibrio elettrochimico dello ione Eccitabilità_1

flusso netto di K+ nullo IL POTENZIALE ELETTROCHIMICO membrana selettiva ad un solo ione flusso netto di K+ nullo DV = 0 flusso netto di K+ da I a II equilibrio tra gradiente elettrico e chimico DV 0  Il potenziale elettrochimico di uno ione deriva da: - il gradiente ionico tra i compartimenti intra- ed extracellulare (lavoro delle pompe ioniche) - la permeabilità selettiva della membrana (presenza di canali ionici selettivi) Eccitabilità_1

L’equazione di Nernst per calcolare il potenziale di equilibrio di uno ione Il potenziale elettrochimico (m) di uno ione (x) è definito come: mx = RT ln[x] + zFEx R = costante dei gas = 8.315 (J K-1 mol -1) F = costante di Faraday = 9.649 x 104 (C mol -1) z = valenza T = temperatura assoluta E = potenziale elettrico La differenza di potenziale elettrochimico dello ione attraverso la membrana è: Dmx = mI(x) - mII(x) = RT ln[x]I/[x]II + zF(EI- EII) in condizioni di equilibrio: Dmx = 0 da cui : EI- EII = RT/zF ln[x]II/[x]I Eccitabilità_1

Ex = 58 mV log[x]II/[x]I Esempio: Regola: Nel caso di una membrana cellulare, per convenzione si assume EII = 0 (lato extracellulare), quindi: Ex = RT/zF ln[x]II/[x]I (equazione di Nernst) ad una temperatura di 20° C, con z = +1 il rapporto RT/zF vale 25.2 mV e ricordando che: ln x = 2.303 log x possiamo riscrivere l’equazione di Nernst come: Ex = 58 mV log[x]II/[x]I Hermann Walther Nernst, Premio Nobel per la chimica nel 1920. Studi di elettrochimica prima del 1900. Esempio: Consideriamo una membrana come nell’esempio precedente, permeabile unicamente al K+, in cui [K]i = 10 [K]e. In queste condizioni: EK = 58 mV log[K]e/[K]i = 58 mV log 0.01/0.1 = 58 mV log 1/10 = -58 mV (è negativo!!!) Regola: La differenza di potenziale aumenta di 58 mV quando il rapporto delle concentrazioni dello ione permeante aumenta 10 volte. Eccitabilità_1

Dipendenza di EK dal K+ extracellulare se una membrana è permeabile ad una sola specie ionica, ad esempio K+, all’equilibrio: Vm = EK la membrana si comporta come un elettrodo al K+ 1/10 IK = gK (Vm-EK) Vm Circuito equivalente di una membrana cellulare permeabile solo al K+ - L’equazione di Nernst appena descritta permette di fare alcune importanti considerazioni sulle proprietà della membrana cellulare. Per prima cosa, il fatto che una membrana permeabile ad un solo ione generi una differenza di potenziale uguale al potenziale di equilibrio di quello ione equivale a considerare la membrana come un vero e proprio generatore di tensione e quindi a conferirgli un aspetto del tutto singolare dal punto di vista fisiologico. La membrana assume infatti funzioni attive di generatore di energia elettrica potenzialmente capace di svolgere funzioni complesse. Dal punto di vista elettrico, ciò equivale a considerare la membrana composta sia da elementi passivi come i canali ionici e il doppio strato lipidico, a cui si può associare rispettivamente un elemento conduttivo (gX) e un elemento capacitativo (C), sia da elementi attivi come il potenziale di equilibrio dello ione X a cui si può associare una batteria con tensione uguale ad EX. In figura sono schematicamente illustrate le condizioni di equilibrio di Nernst per una membrana che contiene solo canali del K+. Eccitabilità_1

Potenziali di equilibrio di altri ioni permeanti ENa= RT/zF ln [Na]e/[Na]i ECa= RT/zF ln [Ca]e/[Ca]i ECl= RT/zF ln [Cl]i/[Cl]e nel caso di concentrazioni intra- ed extracellulari di una cellula muscolare scheletrica di rana: ione conc. intracellulare (mM) conc. extracellulare (mM) Na+ 12 145 K + 155 4 Ca2+ 10-7 (M) 1.5 Cl - 4.2 123 si ottengono i seguenti valori dei potenziali di equilibrio: Esercizio a casa: calcolare i valori di ENa, EK, ECa e ECl usando i valori della tabella in alto. I valori dei potenziali sono calcolati come nel libro usando: 58 mV log [Xo]/[Xi] ENa= +63 mV EK= – 90 mV ECa= +121 mV ECl= – 85 mV Eccitabilità_1

Dipendenza del potenziale di membrana dal K+ extracellulare ovvero il potenziale di riposo di una cellula non segue la legge di Nernst Vm= RT/zF ln[Ke]/[Ki] Se Ke=Ki Vm =0 Se Ko<Ki Vm è negativo ed è sempre più negativo al dimimuire di Ko Importante: L’eq. di Nernst è in grado di predire il potenziale di riposo di una cellula solo se quest’ultima è permeabile ad una sola specie ionica. Anche se non direttamente,quindi la relazione di Nernst tiene conto delle proprietà di permeabilità di ciascuna membrana. Sapendo che tutte le cellule esprimono comunemente canali per i vari ioni (Na+, K+, Ca2+ e Cl–), l’eq. di Nernst richiede che, se la membrana è permeabile al K+, dovrà essere totalmente impermeabile agli altri ioni. E’ giusto chiedersi se questa sia una condizione fisiologica accettabile. Nel caso di molti neuroni e di altre cellule eccitabili l’equazione di Nernst predirebbe a riposo un potenziale di circa –90 mV se le cellule fossero solo permeabili al K+ ma i potenziali di riposo effettivamente misurati sono in media tra –60 e –70 mV, ossia decisamente più positivi. Questo significa che oltre al K+ altri ioni devono essere coinvolti nel mantenere il potenziale di riposo della cellula. In effetti, molte cellule a riposo sono debolmente permeabili al Na+. In tal caso, il Na+ che è maggiormente concentrato all’esterno può entrare nella cellula e rendere il potenziale di membrana più positivo. Risulta quindi evidente che il valore del potenziale di riposo di una cellula non dipende solo esclusivamente dai gradienti ionici dei vari ioni ai lati la membrana ma anche dalle proprietà di permeabilità di quest’ultima ai vari ioni. Il potenziale di riposo della membrana segue la legge di Nernst per [K+]ext > 5 mM (in condizioni non fisiologiche) Quando [K+]ext < 5 mM i punti sperimentali differiscono dalla retta e seguono l’equazione di Goldman La deviazione dei punti sperimentali dalla retta che descrive EK (potenziale di Nernst per il K+), indica che la membrana a riposo è permeabile almeno a due ioni (Na+ e K+). Eccitabilità_1