Linfociti B e Anticorpi Immunità Umorale:

Immunità Umorale

I linfociti B La produzione dei linfociti B avviene nel midollo osseo, ma viene completata negli organi linfoidi periferici (ad es. la milza).

Identificazione Tramite marcatori di membrana (CD) che oltre ad identificare le sottopopolazioni hanno attività uniche CR1 (CD 35) CR2 (CD 21) CD 19 BCR CD 20 Ig-α Ig-β FcγRII CD 32 HLA-DR

Repertorio Anticorpale E’ dato da tutte le specificità anticorpali disponibili in un individuo. 1011 Il numero di anticorpi con specificità diversa per ciascun individuo dipende dal numero di lif.B che possiede e dal numero di Ag con cui è venuto in contatto

Riarrangiamento genico Ciascun tipo di segmento genico è presente in più copie nel genoma germinale. Durante il riarrangiamento genico, la selezione di un segmento caratterizzante ogni variante avviene casualmente per assicurare la variabilità Dopo che i linfociti B hanno incontrato e sono stati attivati dall’Ag avvene l’ipermutazione somatica. Mutazioni puntiformi nella regioni V, per un ulteriore variabilità

Sono presenti molti segmenti genici che insieme codificano per la regione VARIABILE Numero di segmenti genici funzionali nei loci delle Ig umane Segmento Catene leggere Catene pesanti κ λ H Variabile (V) 40 30 65 Diversità (D) 27 Giunzione (J) 5 4 6

ORGANIZZAZIONE DEI LOCI IgH NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA Momento cruciale della differenziazione B-linfocitaria Ag-indipendente è il riarrangiamento dei geni VH delle Ig. Inizia con la traslocazione di uno o più dei geni D (diversity) accanto a uno dei geni JH (joining) e la delezione del DNA compresa fra i due geni. La traslocazione DJ si verifica su entrambi i cromatidi del cromosoma 14. Le fasi successive avvengono in uno solo, dove uno dei 45 o più geni VH (variable) viene traslocato accanto al DJ e forma un complesso continuo VDJ che codifica per l'intera regione variabile della catena pesante μ. Si forma così un trascritto VHDJH-Cμ che viene prima elaborato con eliminazione delle zone ‘ridondanti’ (splicing dell’ mRNA) e poi tradotto in una catena pesante μ. Le catene pesanti H e le catene leggere K e lambda sono codificate da famiglie multigeniche su catene differenti. Durante la maturazione dei linf. B i segmenti genici codificanti vengono riarrangiati Si forma così un trascritto VHDJH-Cμ che viene prima elaborato con eliminazione delle zone ‘ridondanti’ (splicing dello mRNA) e poi tradotto in una catena pesante μ. Se al primo tentativo su uno dei due cromosomi il riarrangiamento VDJ non è produttivo e le traslocazioni geniche risultano in una trascrizione abortiva, la cellula effettua un secondo tentativo utilizzando il secondo cromosoma. Questo meccanismo di controllo preclude la possibilità che una singola cellula produca due diverse catene μ, ognuna con una diversa specificità anticorpale, e impedisce la dispersione della specificità di riconoscimento. L’intera sequenza della regione V o dominio V, della CATENA Pesante o della catena leggera, è contenuta in più segmenti genici. I geni della regione V sono formati da due segmenti. Un segmento V e uno di giunzione J. L’unione dei due segmenti V e J crea un unico esone che codifica l’intera regione V di immunoglobulina Esistono due famiglie di catene leggere negli anticorpi, chiamate kappa e lambda. La Figura 21.12 illustra l’arrangiamento delle parti che compongono il gene che codifica una catena leggera umana della famiglia k. La “colonna A” di questo menù cinese contiene 41 parti delle regioni variabili (V); la “colonna B” contiene 5 parti di regioni di connessione (J). In realtà, i frammenti J codificano gli ultimi 12 amminoacidi della regione variabile, ma sono localizzati lontano dal resto della regione V e nelle immediate vicinanze di una sola regione costante. Questa è la situazione che si riscontra nelle cellule germinali, prima che le cellule preposte alla produzione degli anticorpi comincino a differenziare e prima che i processi di riorganizzazione avvicinino le due regioni. Gli eventi di riarrangiamento e di espressione sono rappresentati in Figura 21.12. In primo luogo un evento di ricombinazione avvicina una delle regioni V a una delle regioni J. In questo caso V3 e J2 si fondono, ma lo stesso sarebbe potuto succedere a V1e J4; la scelta è casuale. Dopo che le due parti del gene si sono assemblate, avviene la trascrizione, che parte dall’inizio di V3 e continua fino alla fine di C. Successivamente, il macchinario di splicing unisce la regione J2 del trascritto a C, eliminando le regioni J inutili e la sequenza tra le regioni J e C. È importante ricordare che il passaggio di riarrangiamento si verifica a livello del DNA, ma questo passaggio di splicing avviene a livello dell’RNA. L’RNA messaggero così assemblato si sposta nel citoplasma per essere tradotto nella catena leggera dell’anticorpo con una regione variabile (codificata sia da V che da J) e una regione costante (codificata da C). Per quale motivo la trascrizione comincia all’inizio di V3 e non a monte? La risposta sembra essere che esiste un elemento enhancer all’interno dell’introne, tra le regioni J e C, che attiva il promotore a lui più vicino: il promotore V3 in questo caso. Questo è anche un modo conveniente per attivare il gene dopo il suo riarrangiamento; solo allora l’elemento enhancer è abbastanza vicino al promotore per accenderlo. Il riarrangiamento della catena pesante, invece, è ancora più complesso perché c’è un’ulteriore serie di porzioni del gene tra le regioni V e J. Questi frammenti del gene sono chiamati D, per diversità, e rappresentano la terza colonna del nostro menù cinese. La Figura 21.13 mostra che la catena pesante viene assemblata a partire da 48 regioni V, 23 regioni D e 6 regioni J. Solo su queste basi, potremmo ottenere 48 × 23 × 6, ovvero 6624 geni diversi per le catene pesanti. Inoltre, 6624 catene pesanti, combinate con 205 catene leggere ê e 170 catene leggere ë, forniscono più di 2,5 milioni di anticorpi differenti o, più precisamente, 2,5 milioni di differenti combinazioni di regioni variabili. Ma esistono molte altre cause di diversità. La prima deriva dal fatto che il meccanismo che unisce i segmenti V, D e J, che noi chiamiamo riunione V(D)J, non è un meccanismo preciso. Può aggiungere o eliminare basi nell’altra estremità della giunzione. Questo comporta differenze ulteriori nelle sequenze amminoacidiche degli anticorpi. Un’altra fonte di differenza tra gli anticorpi è la ipermutazione somatica, ovvero una rapida mutazione delle cellule somatiche (non sessuali) di un organismo. In questo caso le mutazioni si verificano nei geni degli anticorpi, probabilmente nel momento in cui un clone di cellula preposta alla produzione degli anticorpi prolifera e viene a contatto con un intruso. L’analisi genetica e biochimica ha mostrato che l’ipermutazione somatica avviene in due passaggi. Primo, una citidina deamminasi indotta durante l’attivazione delle cellule B deammina le citosine a uracili durante la replicazione del DNA. Successivamente, gli uracili o innescano il meccanismo di riparo da appaiamento errato, che può introdurre mutazioni, oppure richiamano l’uracil-N-glicosilasi, che rimuove gli uracili, lasciando siti abasici. I siti abasici sono poi “riparati” mediante sintesi trans-lesionale (Capitolo 18), che utilizza le DNA polimerasi æ, ç, è e, probabilmente é. Queste polimerasi sono soggette a errori, soprattutto in presenza di siti abasici; pertanto si generano molte mutazioni. Nel complesso, le ricongiunzioni imprecise di segmenti genici e le ipermutazioni somatiche amplificano enormemente il numero di possibili anticorpi. Infatti è stato calcolato che il numero totale di anticorpi che si possono produrre durante la vita supera i 100 miliardi. Questo numero è abbastanza grande per far fronte a ogni tipo di minaccia 14q32.33 regione del locus IGH

Linf. pro-B: derivano dalla cellula staminale, si distinguono dalle altre cellule immature per l’espressione di molecole di superficie ristrette allo stipite B (CD19 e CD10). Nel citoplasma esprimono il TdT (deossinucleotidil transferasi terminale), enzima tipico di tutti i linfociti immaturi, B e T che è importante per il processo di rimaneggiamento dei geni delle Ig e del TCR. Nei linf. pro-B precoci si ha il riarrangiamento del locus della catena pesante che porta al congiungimento dei segmenti D con uno dei segmenti J, accompagnato dalla delezione del tratto di DNA interposto; successivamente nei linfociti pro-B tardivi uno dei segmenti genici VH si collega al complesso DJH. Il I° riarrangiamento o riarrangiamento VDJ si verifica in cellule grandi e attivamente proliferanti. Il risultato finale del riarrangiamento è testimoniato dalla presenza dei linfociti pre-B, cioè di cellule che presentano nel citoplasma catene pesanti μ non accompagnate da alcuna catena leggera. I grandi linfociti pre-B differenziano a piccoli linfociti pre-B che smettono di proliferare e si dedicano unicamente alla differenziazione iniziando a riarrangiare i geni che codificano per le catene leggere secondo una ben precisa gerarchia (Fig. 2-4). Si inizia dalla catena κ e quindi da uno dei due cromosomi 2, con un riarrangiamento VJκ che segue le stesse regole utilizzate dal cromosoma 14 per le catene H (la differenza è l'assenza del segmento D). Un riarrangiamento produttivo VJκ porta ad un adeguato trascritto e alla successiva traduzione di una catena leggera κ. In un terzo circa dei piccoli linfociti pre-B, il riarrangiamento VJκ è improduttivo sia sul primo che sul secondo cromosoma. Il processo prosegue quindi con il riarrangiamento di uno dei due cromosomi 22 (catene leggere λ). La catena leggera (κ o λ) è immagazzinata in vescicole del reticolo endoplasmatico dove si lega alla catena pesante μ. Le molecole di IgM complete vengono portate nella regione del Golgi e successivamente inserite nella membrana. Il linfocita pre-B è così diventato un linfocita B vergine sIgM+ che, attraverso il meccanismo di splicing dello RNA, produce anche IgD con la stessa specificità antigenica delle IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B maturi pronti per essere esportati negli organi linfoidi periferici sono quindi sIgM+, sIgD+. Nel feto, i linfociti pre-B sono identificabili a partire dalla 8a settimana di gestazione e la loro presenza precede di una settimana circa la comparsa dei linfociti B vergini sIgM+. I linfociti B sIgM+ vergini neoformati sono sensibili alla stimolazione del loro recettore sIgM, venendo inattivati, a differenza di quanto si osserva nei linfociti B più maturi che vengono invece attivati dallo stesso trattamento. Questa peculiare caratteristica è considerata uno dei possibili meccanismi attraverso i quali gli autoantigeni possono inattivare i linfociti B autoreattivi formatisi durante la differenziazione e indurre così la tolleranza nei confronti del self.

ORGANIZZAZIONE DEI LOCI IgK NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA regione del locus IGK 11.2 Si inizia dalla catena κ (in uno dei due cromosomi 2), con un riarrangiamento VJκ che segue le stesse regole utilizzate dal cromosoma 14 per le catene H (la differenza è l'assenza del segmento D). Un riarrangiamento produttivo VJκ porta ad un adeguato trascritto e alla successiva traduzione di una catena leggera κ. In un terzo circa dei piccoli linfociti pre-B, il riarrangiamento VJκ è improduttivo sia sul primo che sul secondo cromosoma. Si trova nel braccio lundo del cromosoma

Il primo riarrangiamento (VDJ) si verifica in cellule grandi e attivamente proliferanti. Il risultato finale del riarrangiamento è testimoniato dalla presenza dei linfociti pre-B, che presentano nel citoplasma catene pesanti μ non accompagnate da alcuna catena leggera. I grandi linfociti pre-B differenziano a piccoli linfociti pre-B che smettono di proliferare e si dedicano alla differenziazione iniziando a riarrangiare i geni che codificano per le catene L secondo una ben precisa gerarchia. .

Linf. pre-B: contengono nel loro citoplasma catene pesanti μ libere. Una piccola percentuale delle catene citoplasmatiche μ vengono espresse sulla superficie cellulare in associazione con una catena leggera sostitutiva non polimorfica, diversa dalle catene L k e λ, formando i recettori pre-B, l’espressione dei quali è necessaria per stimolare la proliferazione e far proseguire la maturazione dei linfociti B.

ORGANIZZAZIONE DEI LOCI IgL λ NELL’UOMO NELLA LINEA GERMINATIVA Il processo prosegue con il riarrangiamento in uno dei due cromosomi 22 (catene leggere λ). La catena leggera (κ o λ) è immagazzinata in vescicole del reticolo endoplasmatico dove si lega alla catena pesante μ. Le molecole di IgM complete vengono portate nella regione del Golgi e successivamente inserite nella membrana. 11.22 regione del locus IGH Il linfocita pre-B è così diventato un linfocita B vergine sIgM+ che, attraverso il meccanismo di splicing dello RNA, produce anche IgD con la stessa specificità antigenica delle IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B maturi pronti per essere esportati negli organi linfoidi periferici sono quindi sIgM+, sIgD+.

Linf. B immaturi: producono una catena leggera k o λ, che si associa alla catena pesante μ formando IgM monomeriche, espresse sulla membrana cellulare, dove svolgono la funzione di recettore antigenico. Non possiedono più catene μ citoplasmatiche e perde la positività per la TdT. Questi stadi avvengono nel midollo osseo e sono antigene indipendenti. I linf. B immaturi non proliferano né si differenziano in risposta all’Ag. Ma l’incontro con un Ag le porta in apoptosi o alla inattivazione funzionale. Ciò è in relazione alla selezione negativa dei linf. per la tolleranza al self. I linfociti immaturi trattati con Ab anti-IgM , non esprimono IgM facilmente sulla membrana, anche con quantità basse di Ab, la scomparsa di esse non è seguita da risintesi, come avviene nei B maturi

La sequenza di DNA che codifica per la regione V si forma con la ricombinazione somatica di frammenti genici fra loro separati

Meccanismi di riarrangiamento genico della regione variabile Segnali di ricombinazione In che modo il macchinario di ricombinazione determina dove devono avvenire il taglio e la giunzione che avvicinano le diverse parti del gene di una immunoglobulina? adiacente a ciascuna regione codificante è localizzato un eptamero palindromico molto conservato, caratterizzato dalla sequenza consensus 5′-CACAGTG-3′ Questo eptamero è accompagnato da un nonamero conservato, la cui sequenza consensus è 5′-ACAAAAACC-3′. L’eptamero e il nonamero sono separati da uno spaziatore non conservato contenente 12 bp (un segnale di 12 bp), o da 23 (±1) bp (un segnale di 23 bp). L’organizzazione di queste sequenze-segnale di ricombinazione (RSSs, è tale che la ricombinazione unisce sempre un segnale 12 a un segnale 23. La l’arrangiamento dei segnali 12 e 23 è tale che la giunzione tra un tipo e l’altro permette naturalmente l’assemblaggio di un gene completo. regola 12/23 afferma che i segnali 12 non sono mai uniti gli uni agli altri così come i segnali 23, e questo assicura che una e una soltanto di ciascuna regione codificante sia incorporata in un gene maturo di immunoglobulina. Le sequenze che fungono da segnali di ricombinazione (RSS) nella ricombinazione V(D)J consistono di un eptamero e di un nonamero separate da sequenze spaziatrici di 12 o 23 coppie di basi. La ricombinazione avviene solo tra due sequenze-segnale di tipo 12 o due sequenze-segnale di tipo 23 e questo garantisce che solo una delle due regioni codificanti venga incorporata nel gene riarrangia La RICOMBINAZIONE V(D)J corretta è regolata da sequenze conservate di DNA non codificante adiacenti al punto di ricombinazione (sequenze-segnale di ricombinazione (RSSs): Eptamero -Spaziatote-nonamero L’organizzazione delle RSSs è tale che la ricombinazione unisce sempre un segnale 12 a un segnale 23 (REGOLA 12/23, che assicura il riarrangiamento nell’ordine corretto)

LA RICOMBINAZIONE V(D)J Giunzione per delezione: i segmenti genici da congiungere hanno lo stesso orientamento trascrizionale. Questo processo da origine a 2 prodotti una riarrangiata VJ che è la giunzione codificante e un prodotto di delezione (RSS-giunzione segnale e DNA interposto) Giunzione per inversione: i segmenti genici hanno orientamento trascrizionale opposto. In questo vengono mantenute le RSS-giunzione segnale e DNA interposto, e l’orientamento di uno dei 2 segmenti congiunti viene invertito

La RICOMBINAZIONE V(D)J Coinvolge enzimi linfocitari Specifici Ubiquitari (DNA ligasi) e DNA Ku Figura 21.14 Segnali per la giunzione V(D)J. (a) Arrangiamento dei segnali intorno alle regioni codificanti dei geni per le catene leggere ê e ë e del gene per la catena pesante delle immunoglobuline. I tratti indicati con “7” e “9” sono, rispettivamente, gli eptameri e i nonameri conservati. Le loro sequenze consensus sono riportate nella parte alta della figura. Sono stati indicati anche gli spaziatori di 12 e 23 coppie di basi. Si noti che l’arrangiamento dei segnali 12 e 23 è tale che la giunzione tra un tipo e l’altro permette naturalmente l’assemblaggio di un gene completo. (b) Illustrazione schematica del riarrangiamento dei segnali 12 e 23 in un gene di una catena pesante dell’immunoglobulina. I triangoli gialli rappresentano i segnali 12, quelli arancione rappresentano i segnali 23. Notare nuovamente come la regola 12/23 garantisce l’inclusione di una sola delle regioni codificanti (V, D e J) nel gene riarrangiato. (Da: (a) Tonegawa, S., Somatic generation of antibody diversity. Nature 302: 577, 1983. Capitolo 21 La trasposizione • W15 regola 12/23 afferma che i segnali 12 non sono mai uniti gli uni agli altri così come i segnali 23, e questo assicura che una e una soltanto di ciascuna regione codificante sia incorporata in un gene maturo di immunoglobulina. A parte l’esistenza delle sequenze consensus RSS, quali prove esistono della loro importanza? Martin Gellert e colleghi hanno mutagenizzato in maniera sistematica l’eptamero e il nonamero sostituendo alcune basi, e le regioni spaziatrici aggiungendone o sottraendone altre, e hanno osservato gli effetti di queste alterazioni sulla ricombinazione. Essi misurarono l’efficienza di ricombinazione come segue: costruirono dapprima un plasmide ricombinante con il costrutto mostrato in Figura 21.15. Il primo elemento in questo costrutto è un promotore lac. Questo è seguito da un segnale 12, quindi da un terminatore procariotico della trascrizione e da un segnale 23 e, infine, da un gene reporter cat. Successivamente generarono delle mutazioni lungo le sequenze RSS e introdussero il plasmide alterato in una linea cellulare pre-B. Infine, purificarono i plasmidi dalle cellule pre-B e li introdussero all’interno di cellule di E. coli resistenti al cloramfenicolo. Successivamente saggiarono le cellule rispetto alla resistenza per il cloramfenicolo stesso. Se non avesse avuto luogo alcuna ricombinazione, allora il terminatore della trascrizione avrebbe impedito l’espressione del gene cat e di conseguenza la resistenza al cloramfenicolo sarebbe stata inesistente. Al contrario, qualora la ricombinazione tra il segnale 12 e il 23 fosse avvenuta, il terminatore sarebbe risultato o invertito o deleto e quindi inattivato. In questo caso, l’espressione di cat sarebbe avvenuta sotto il controllo del promotore lac e si sarebbe osservata la crescita di numerose colonie resistenti al cloramfenicolo. Questo esperimento ha mostrato che molte alterazioni nella sequenza di coppie di basi sia nell’eptamero che nel nonamero causavano una riduzione nell’efficienza di ricombinazione fino a un livello di fondo. La stessa cosa si osserva nel caso di delezioni o inserzioni di basi nelle regioni spaziatrici. Così, tutti questi elementi delle sequenze RSS risultano importanti per la ricombinazione V(D)J. SOMMARIO Le sequenze che fungono da segnali di ricombinazione (RSS) nella ricombinazione V(D)J consistono di un eptamero e di un nonamero separate da sequenze spaziatrici di 12 o 23 coppie di basi. La ricombinazione avviene solo tra due sequenze-segnale di tipo 12 o due sequenze-segnale di tipo 23 e questo garantisce che solo una delle due regioni codificanti venga incorporata nel gene riarrangia V(D)J RICOMBINASI: RAG-1 e RAG-2 (Specifici per il sistema linfoide)

Taglio endonucleotidico (RAG1 e RAG2) : RAG1 riconosce il nonamero I complessi proteici si legano fra loro avvicinando i segmenti che si devono ricongiungere Il DNA viene tagliato in modo da formare delle strutture a forcina nelle terminazioni dei segmenti delle Ig Alle strutture a forcina e alle terminazioni aperte delle RSS si legano gli enzimi riparativi (ligasi: Ku70:Ku80 etc) Le forcine di DNA vengono tagliate casualmente. Possono essere aggiunte delle basi dalla TdT oppure eliminate da un’ endonucleasi per generare tagli imprecisi. La DNA ligasi IV ricongiunge le terminazioni si forma la GIUNZIONE CODIFICANTE

AGGIUNTA DEI NUCLEOTIDI PER RIPARARE ROTTURE ASIMMETRICHE O PER GENERARE NUOVE SEQUENZE

DOMINI DELLE PROTEINE Ig Nel feto, i linfociti pre-B sono identificabili a partire dalla 8a settimana di gestazione e la loro presenza precede di una settimana circa la comparsa dei linfociti B vergini sIgM+. I linfociti B sIgM+ vergini neoformati sono sensibili alla stimolazione del loro recettore sIgM, venendo inattivati, a differenza di quanto si osserva nei linfociti B più maturi che vengono invece attivati dallo stesso trattamento. Questa peculiare caratteristica è considerata uno dei possibili meccanismi attraverso i quali gli autoantigeni possono inattivare i linfociti B autoreattivi formatisi durante la differenziazione e indurre così la tolleranza nei confronti del self.

Linfociti B maturi vergini (naive): caratterizzati dalla co-espressione di IgM e IgD sulla superficie cellulare, oltre ai recettori C3 per il complemento, Fc per le Ig, e di antigeni MHC di seconda classe. Su ogni cellula entrambi gli isotipi espressi sono dotati di una medesima regione V ed hanno pertanto un’identica specificità antigenica.

STADI DELLA MATURAZIONE DEI LINFOCITI

(RICOMBINAZIONE SOMATICA) DIVERSIFICAZIONE DEI GENI PER IL RECETTORE PER L’ANTIGENE NELLE CELLULE B (RICOMBINAZIONE SOMATICA) Un’ulteriore diversità anticorpale che avviene nelle unità geniche riarrangiate delle regioni V Mutazioni con sostituzioni nucletodiche e non per delezioni o inserzioni Avviene nei centri germinativi degli organi linfoidi secondari dopo un’immunizzazione con un Ag per dotare i recettori dei linf. B di maggiore affinità per l’Ag. Selezione di cellule B con maggiore affinità MATURAZIONE DI AFFINITA’

© 2005 Elsevier

DELLE VARIE CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE GLI ANTICORPI STRUTTURA E FUNZIONE DELLE VARIE CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE

Paul Erlich 1894 “Ipotesi della catena laterale” 1950 “ Selezione clonale delle cellule B” David Talmage and Sir Frank Macfarlane Burnet 1936 Karl Landsteiner “Il sistema immunitario può reagire con un numero illimitato di Ag” 1940 Linus Pauling Teroria dell’”Istruzione” “Ab molecole flessibili che si modellano con l’Ag”

(Effettori della risposta adattativa umorale) GLI ANTICORPI (Effettori della risposta adattativa umorale) Catena leggera Catena pesante C V Siti di legame per l’antigene Gli Ab o immunoglobuline (Ig) sono glicoproteine multimeriche, appatenenti alla famiglia delle GLOBULINE (proteine globulari del siero). Sono prodotte in risposta ad un Ag e sono capaci di formare un legame specifico con la sostanza che li ha indotti. Si trovano in forma solubile, o sono espresse nelle mebrane dei linf.B

Le Ig, sono costituite da due tipi di catene legate da ponti S-S, e da una quota di 4-18% di carboidrati. L'unità di base delle Ig ha un PM di ~150 KD. Consta di due catene leggere L (light) e di due pesanti H (heavy). Le catene sono unite tra loro soprattutto da ponti S-S ed in minor misura da forze non covalenti. Ciascuna catena è costituita da una parte costante (CH e CL) ed una variabile (VH e VL). Nelle regioni V, equivalenti al sito di legame per l'Ag la sequenza di Aa varia nei diversi anticorpi. Le catene sono ripiegate tridimensionalmente in loops o domains (domini globulari), determinati da legami S-S intracatena: le catene leggere hanno una sola VL ed una CL. Le pesanti hanno invece VH, CH1, CH2, CH3.

Le molecole Ig sono clivate dagli enzimi papaina (A) e pepsina (B). FRAMMENTI PROTEOLITICI DI UNA IMMUNOGLOBULINA Le molecole Ig sono clivate dagli enzimi papaina (A) e pepsina (B). La digestione con papaina permette la separazione di due frammenti in grado di legare l’antigene (frammenti Fab), dalla porzione dell’anticorpo IgG che attiva il complemento e che si lega ai recettori Fc (frammento Fc). La digestione con pepsina genera un singolo frammento bivalente in grado di legare l’antigene F(ab’)2

CLASSI E SOTTOCLASSI DELLE Ig Nell’uomo esistono 5 classi principali ed alcune sottoclassi di Ig con proprietà chimico-fisiche (peso molecolare, carica…), biologiche (opsonizzazione) e sierologiche (reazione con l’Ag) diverse che dipendono dalla struttura primaria delle catene pesanti.

Si distinguono 5 tipi di catene pesanti che determinano la classe dell’Ab

Caratteristiche delle IgM Possono trovarsi sia in forma: MONOMERICA (presenti sulla membrana del linfocita B maturo) PENTAMERICA (circolanti nel siero). Sono le prime Ig ad essere prodotte durante la risposta immunitaria. Sono presenti in concentrazioni piuttosto basse (5-10%). Hanno un’elevata capacità di attivazione del complemento.

Basta che una sola molecola di IgM si leghi ad un antigene per attivare la prima cellula del complemento, questo innesca una cascata di reazioni che provoca la perforazione delle cellule nemiche e la loro morte.

STRUTTURA DI UNA IgM DI MEMBRANA Le IgM hanno un dominio in più nella catena pesante rispetto alle IgG ed ha porzioni citoplasmatiche che ancorano la molecola alla membrana.

Caratteristiche delle IgG Sono le più abbondanti nel siero (~80%). Sono le uniche Ig veramente efficace conto i batteri, le loro tossine, i virus e gli altri agenti infettivi più diffusi. Sono in grado di legarsi ad un gran numero di polimorfonucleati (granulociti, macrofagi e cellule NK). Sono in grado di attivare il complemento (Attraverso la via classica; tranne il sottotipo IgG4) Sono in grado di attraversare la placenta Si presentano come MONOMERI

STRUTTURA DELLE IgG I siti che legano l’Ag sono formati dalla giunzione di domini variabili di catene leggere (VL) e catene pesanti (VH). Catene pesanti in blu e rosso. Catene leggere in verde e i carboidrati sono mostrati in grigio

Si possono distinguere 4 sottoclassi: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 Si possono distinguere 4 sottoclassi: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Le sottoclassi 1 e 3 stimolano la reazione del complemento e intervengono nella risposta immunitaria secondaria

STRUTTURA DELLA CATENA LEGGERA DI UN ANTICORPO CL VL VL CL Le regioni varabili (V) e costanti (C) si ripiegano indipendentemente in due domini IG. Ogni dominio è composto da due serie antiparallele di foglietti b (le frecce rosse e gialle). I tratti blu si riferiscono a due ponti disolfuro.

LEGAME DI UN ANTIGENE ALL’ANTICORPO

Caratteristiche delle IgA Rappresentano la II classe di Ig circolanti con ~ il 10-15%. Si trovano in % molto alta nelle secrezioni:Latte, saliva, lacrime, secrezioni nasali) e a livello delle mucose del tratto bronchiale e digerente dove impediscono l’aderenza dei microrganismi all’epitelio impedendone la proliferazione Esistono sottoclassi IgA1 e 2, le IgA1 prevalgono nel siero, le IgA2 nelle secrezioni, anch’esse dipendono da differenze antigeniche nella CH. Le IgA secretorie si trovano esclusivamente nelle secrezioni esterne, (lacrime, saliva, secrezioni intestinali, colostro), in cui il rapporto IgG/IgA è <1 In quelle non  in contatto con l'esterno (sinovia, liquido amniotico, pleurico e  peritoneale) il rapporto IgG/IgA è di 5:1, simile a quello del  siero.

Le IgA che vengono immagazzinate nelle secrezioni mucose sono prodotte in forma dimerica, mentre quelle presenti nel siero sono in forma monomerica; Le IgA assorbite dal circolo sanguigno sono molto poche e infatti rappresentano soltanto il 25% delle Ig sieriche totali. Immunità a livello delle mucose Le IgA sono prodotte soprattutto a livello del tessuto linfoide associato alle mucose (MALT) del tratto digerente e respiratorio, e in misura minore anche nella bile, nella saliva e nel latte materno. La loro produzione da parte delle plasmacellule è stimolata da TGF-β, prodotto da cellule sia dell'immunità innata che di quella specifica, e l'IL-5, prodotta da linfociti T helper del sottotipo TH2. Le cellule che producono le IgA si trovano nella tonaca mucosa, al di sotto dell'epitelio. Una volta secrete nell'ambiente extracellulare, le IgA dimeriche si legano ad uno speciale recettore per la loro porzione Fc presente sulla superficie interna delle cellule epiteliali, chiamato recettore poli-Ig (perché presenta cinque domini Ig). Questo recettore legato alla IgA viene quindi internalizzato per endocitosi nella cellula epiteliale della mucosa, e viaggia in una vescicola endocitotica fino al versante luminale della cellula: a questo punto, la vescicola si fonde con la membrana plasmatica e la porzione del recettore poli-Ig contenente i cinque domini Ig viene clivata e secreta nel lume assieme alla IgA, prendendo così il nome di "componente secretoria". Le IgA secrete nel lume vanno a mischiarsi nel muco prodotto dalle cellule epiteliali e costituiscono una prima barriera difensiva contro i microbi, ai quali si vanno a legare non appena entrano a contatto con la parete del lume digerente o respiratorio.

IgA e IgG e Immunità neonatale Nel latte materno sono presenti grandi quantità di IgA e di IgG, che vengono ingerite dal neonato e vanno a sterilizzarne l'apparato digerente proteggendolo dalle intrusioni di eventuali microbi. Le IgA sono molto importanti per la trasmissione di una prima forma di difesa dalla madre al lattante, che nei primi sei mesi di vita è incapace di produrre anticorpi suoi. Le IgG, inoltre, vengono anche assorbite nel circolo neonatale

IgE Sono presenti nel siero alla concentrazione di 0.003% Una volta prodotte, si legano ai recettori per il frammento Fc espresso dai mastociti, si aggregano e danno inizio ad un processo detto di DEGRANULAZIONE mediante il quale si liberano i mediatori chimici Negli individui non allergici, un’elevata concentrazione di IgE indica una infestazione di tipo parassitario.

Caratteristiche delle IgD Si presentano come monomeri. Costituiscono circa l’1% delle Ig circolanti. La loro funzione non è chiara: sembra che abbiano funzione di recettore per l’antigene.

LINFOCITI B: COESPRESSIONE DI IgM E IgD Le IgD si ritrovano soltanto sulla superficie dei linfociti B immaturi, assieme alle IgM, ed hanno come unica funzione quella di attivare i linfociti B e di promuovere la loro maturazione verso lo stadio di plasmacellule quando vengono a contatto con l‘Ag per il quale sono specifiche.

ISOTIPI DEGLI ANTICORPI UMANI Isotipo dell’ anticorpo Sottotipo Catena H Concentr. nel siero (mg/ml) Emivita Plasmatica (giorni) Funzioni IgA IgA1, 2 a (1 o 2) 3.5 6 Immunità delle mucose IgD Nessuno d Tracce 3 Recettore per l’ag dei linfociti B naive IgE e 0.05 2 Ipersensibilità immediata, difesa contro gli elminti IgG IgG1-4 g (1,2,3 o 4) 13.5 23 Opsonizzazione, attivazione del complemento, citotossicità Ab-dipendente e cellulare, immunità neonatale, feedback inibitorio delle cellule B IgM m 1.5 5 Recettore per l’Ag dei linfociti B naive, attivazione del complemento

PROCESSI DI SELEZIONE NELLA MATURAZIONE LINFOCITARIA

Il linfocita pre-B è così diventato un linfocita B vergine sIgM+ che, attraverso il meccanismo di splicing dello RNA, produce anche IgD con la stessa specificità antigenica delle IgM che a queste si affiancano sulla superficie. I linfociti B maturi pronti per essere esportati negli organi linfoidi periferici sono quindi sIgM+, sIgD+.

FLESSIBILITA’ DELLE MOLECOLE ANTICORPALI I due siti anticorpali che legano l’Ag si possono legare contemporaneamente a due determinanti separati da distanze diverse. (A) la molecola di Ig si lega a due epitopi espressi su una membrana cellulari ben distanziati fra loro. (B) lo stesso anticorpo si lega a due determinanti situati in posizione ravvicinata. Tale flessibilità è dovuta alla regione cerniera localizzata tra il primo e il secondo dominio costante della catena pesante (CH1 e CH2) che consente il movimento dei siti combinatori in maniera indipendente dal resto della molecola.

Attivazione del complemento inattiva gli antigeni tramite Neutralizzazione Agglutinazione di cellule Precipitazione di Ag in soluzione Attivazione del complemento Lisi della cellula Fagocitosi Virus Batterio Batteri Molecole di Ag Molecole del complemento Cellula estranea Macrofago Favoriscono la Porta alla Il legame Ab - Ag inattiva gli antigeni tramite Gli Ab promuovono l’eliminazione dell’Ag attraverso vari meccanismi sistema immunitario