Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla

La Cromatografia è una tecnica di separazione Essa trova impiego sia in campo analitico che preparativo Il nome cromatografia significa disegno colorato e deriva dalle esperienze iniziali effettuate dal botanico russo Tswett che impiegò il metodo per la prima volta allo scopo di separare i pigmenti colorati delle foglie.

Esperienza di Tswett eluente (fase mobile) Una colonna di vetro è riempita con Al2O3 in polvere (fase fissa) ed un solvente in cima alla colonna si versa una soluzione di pigmenti. Si procede quindi al lavaggio (eluizione) della colonna con un solvente (fase mobile) colonna cromatografica III bande cromatografiche II I riempimento Al2O3 (fase fissa)

cromatografiche in cammino Esperienza di Tswett eluente man mano che si aggiunge solvente e procede l’eluizione le bande si spostano verso il basso finché si raccolgono nei vasi posti in basso colonna cromatografica bande cromatografiche in cammino III II I

L’eluizione è quasi completa eluente L’eluizione è quasi completa Le bande I e II adesso sono uscite e sono state raccolte in due contenitori diversi Per la sostanza III bisogna continuare l’eluizione. colonna cromatografica la banda cromatografica III si è spostata in fondo alla colonna III bande cromatografiche già eluite I e II II I

La cromatografia è basata su quattro fenomeni fondamentali: Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico Esclusione

Adsorbimento E’ dovuto alle deboli forze di attrazione che esistono tra le molecole di un solido e quelle di un liquido (o di un gas) con cui il solido si trova a contatto. Un esempio comune di adsorbimento si verifica tra il fumo di sigaretta e la lana dei vestiti o i capelli. L’adsorbimento è un fenomeno reversibile infatti basta far arieggiare gli indumenti per attenuare l’odore del fumo.

Adsorbimento la quantità di adsorbato dipende dalla superfice di contatto tra il gas ed il solido. ma dipende anche dalla pressione del gas e dalla temperatura. Riscaldando il sistema le molecole di gas tendono a staccarsi dalla fase fissa

Equazione di Freundlich L’adsorbimento è illustrato dall’equazione di Freundlich Cf = a P1/n in cui :Cf = conc. nella fase fissa P = pressione del gas a ed n dipendono dalla natura delle sostanze e dalla temperatura Cf saturazione In genere si scelgono le condizioni operative lontane dalla saturazione dove l’andamento è quasi rettilineo pressione

Ripartizione Si abbia un sistema costituito da due fasi L1 e L2 (es.: gas/liquido come aria e acqua oppure due liquidi non miscibili come acqua /olio) si aggiunga una terza sostanza S che sia solubile in entrambi i liquidi in questa rappresentazione i puntini indicano le molecole di sostanza S ; le freccette invece indicano il movimento di queste tra le due fasi sino al raggiungimento dell’equilibrio L1 L2

Ripartizione Equaz. di Nernst La sostanza S si scioglie ripartendosi tra le due fasi L1 e L2 secondo l’equazione di Nernst CL1/CL2 = K (costante) CL1= Conc di S in L1 ; CL2 = Conc di S in L2 K = dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura. CL1 CL2

Ripartizione molecole di gas Nelle colonne cromatografiche la ripartizione si realizza impregnando con una sostanza oleosa i microgranuli che riempiono la colonna sito di adsorbimento sito di ripartizione

Ripartizione /Adsorbimento Come si vede sia il diagramma dell’adsorbimento a pag. 8 che quello della ripartizione a pag. 10 hanno lo stesso andamento. Per descrivere la separazione si preferisce quindi parlare di: concentrazione in fase fissa concentrazione in fase mobile Cfissa A B Cmobile

Separazione tra due sostanze A e B Come si vede la fase fissa trattiene la sostanza A con maggiore forza rispetto alla sostanza B Infatti Cf A> Cf B Cfissa A B Cmobile Quindi il gas oppure il solvente della fase mobile trascina la sostanza B mentre A resta indietro.

Scambio ionico Alcune sostanze polimeriche hanno la proprietà di scambiare ioni H+ oppure ioni OH-grazie alla presenza di particolari gruppi funzionali R--SO3H+ Na R--SO3 Na + H+ Una colonna cromatografica riempita con resina scambiatrice può separare sostanze ioniche

Esclusione o permeazione di gel Una sostanza polimerica dispersa in un solvente può cadere o meno entro le porosità di un gel a seconda delle sue dimensioni. polimero di piccole dimensioni percorso GEL Una molecola di piccole dimensioni ritarda nell’uscire dalla colonna perchè penetra nei pori e compie un percorso più lungo

Esclusione o permeazione di gel Invece una molecola polimerica di grandi dimensioni trova difficoltà a penetrare nel gel e viaggia più velocemente lungo la colonna. polimero di grandi dimensioni percorso GEL

Le principali modalità di esecuzione di una cromatografia in fase liquida (LC) su carta su colonna su strato sottile (TLC) in fase gassosa (GC) su colonna a riempimento su colonna capillare Un ulteriore metodo è la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC )

Cromatografia su carta (ascendente) Come supporto di adsorbimento o scambio ionico si usa una speciale carta da filtro . Una goccia del campione viene depositata alla base del foglio ed asciugata. Il foglio così preparato viene chiuso in una camera di vetro con un po’ di solvente sul fondo, in modo che il solvente tocchi la base de foglio Il foglio viene imbevuto lentamente per capillarità. Mentre il solvente sale i componenti vengono separati . campione standards di confronto

Cromatograia su strato sottile(TLC) E analoga a quella su carta con la differenza che come supporto si usa il materiale di riempimento delle colonne. La polvere usata per riempire la colonna viene depositata su una lastra di vetro, in forma di impasto in strato sottile. I componenti sono separati ed identificati per confronto con sostanze note campione standards di confronto

Caratteristiche più appariscenti Sia la cromat. su carta che la TLC consentono con attrezzature elementari di effettuare separazioni non distruttive su quantità inferiori al milionesimo di grammo, in condizioni operative blande. I componenti possono essere recuperati ritagliando la carta oppure raschiando la polvere della lastra. Se il composto non è colorato si può rivelare o mediante fluorescenza ai raggi UV oppure con reazioni chimiche che danno una reazione cromatica.

Cromatografia preparativa La cromatografia su colonna può essere effettuata sia su scala analitica che su scala industriale. In laboratorio si usano colonne con diametro 1-:-2 cm e lungh. di 20-:-30 cm Su scala industriale si usano colonne con dimensioni 10 volte più grandi. La cromatografia preparativa è importantissima nella separazione e purificazione di complesse sostanze naturali termolabili e con caratteristiche similari come enzimi, o proteine, ac. nucleici, immunopolisaccaridi,ormoni etc.

Gas Cromatografia amplif. colonna cromatografica registr. iniettore La miscela gassosa passa quindi in una colonna ove avviene la separazione. Un rivelatore posto all’uscita invia un segnale elettrico ad un amplificatore e quindi ad un registratore grafico. La condizione necessaria per la separazione gas-cromatografica è che le sostanze da analizzare siano facilmente vaporizzabili 1/1000 di cc di Campione viene iniettato in un microevaporatore caldo , e quindi viene trascinato da una corrente di gas detto carrier. amplif. colonna cromatografica registr. iniettore detector uscita dei gas bombola carrier

Gas Cromatografia amplificatore stufa termostatica registratore Anche la colonna deve essere riscaldata per evitare la condensazione del campione Come gas carrier si usano Idrogeno,oppure Azoto, oppure Elio. La separazione cromatografica somiglia alla distillazione frazionata. Quindi il potere separatore di una colonna cromatografica viene contraddistinta dal numero di piatti teorici Una colonna impaccata ha 5mm e lungh 3 -:- 5 m Una colonna capillare ha mm e lungh 30-:- 100 m amplificatore stufa termostatica registratore colonna cromatografica iniettore detector uscita dei gas bombola carrier

Rivelatori per G.C. HWD :hot wire detector , in Inglese rivelatore a fili caldi HWD è basato sulla differenza di conducibilità termica delle sostanza rispetto al carrier. Una resistenza elettrica calda viene più o meno raffreddata al passaggio del gas. La resistenza varia il proprio valore e genera un segnale elettrico. Nell’HWD quattro resistenze sono collegate a formare un ponte di Westone. Una delle resistenze è a contatto con il carrier puro mentre un’altra è a contatto con il gas in uscita. colonna cromat. iniettore + - segnale + - resistenza uscita gas

Rivelatori per GC FID: Flame Ionization Detector ; in Inglese rivelatore a ionizzazione di fiamma. Il gas in uscita dalla colonna viene immesso in una microfiamma H2 /aria ove vengono bruciate le sostanze analizzate. Nella combustione si formano frammenti molecolari dotati di cariche elettriche. Questi ioni posti in un campo elettrico danno luogo ad un segnale. + - + segnale - + aria Idrogeno carrier

Segnale del detector e cromatogramma il grafico ottenuto è detto picco cromatografico o cromatogramma Quando una sostanza esce dalla colonna incontra il detector. Le molecola di una sostanza non escono tutte contemporaneamente, ma si comportano come una folla che percorre una strada. All’inizio ci sono poche molecole, poi queste aumentano raggiungendo un massimo per poi diminuire sino a sparire . segnale tempo Profilo del segnale

Segnale del detector e cromatogramma tempo Profilo del segnale nel caso di un campione contenente 4 componenti

Analisi Qualitativa/Quantitativa in Cromatografia Analisi quantitativa La quantità di sostanza è proporzionale alla superfice del picco. Il picco ha una forma curvilinea, ma per semplicità di calcolo si approssima ad un triangolo Oggi esistono apparecchiature automatiche dette integratori che calcolano la superfice. Per risalire alla concentrazione di ogni componente si calcola la superfice %ale di ogni componente, moltiplicata per un opprtuno coefficiente. Analisi qualitativa Stabilite le condizioni sperimentali, un composto è individuato dal tempo che la sostanza impiega a percorrere tutta la colonna (tempo di ritenzione) Il tempo di ritenzione si misura tra il momento dell’iniezione ed il punto di massimo del picco cromatografico.

Analisi Qualitativa/Quantitativa in Cromatografia Per l’ individuazione di una sostanza è necessario effettuare un confronto con la stessa sostanza allo stato puro La sostanza di confronto è detta standard. Analisi quantitativa La risposta del detector è diversa per ogni sostanza. La risposta del detector dipende dalle condizioni operative. Per conoscere la quantità di un componente bisogna effettuare il confronto con una quantità nota di standard Analisi qualitativa

Gas Cromatografia e temperatura GC ISOTERMA La gas cromatografia deve essere condotta in condizioni di temperatura controllata. Se varia la temperatura variano sia il coeff di ripartizione che il coeff di adsorbimento. Se variano i coefficienti varierà il tempo di ritenzione. GC a temperatura Programmata Alcuni composti impiegano tempi molto lunghi per attraversare la colonna con conseguente diminuizione del potere separatore.. Per abbreviare il tempo di analisi, si aumenta gradatamente la temperat. della colonna in questo caso si parla di Temperatura programmata T= cost

Gas Cromatografia e temperatura GC isoterma. GC a temp. Programmata T= cost Temperatura Temperatura Tfin Tin tempo tempo

Gas Cromatografia a gradiente ( temperatura programmata) 1) fase iniziale di preriscaldamento 2) Rampa aumento di temperatura a gradiente costante T/t °C/min 3) fase finale di spurgo e pulizia della colonna. 4) raffreddamento e predisposizione per un nuovo ciclo( linea rossa ) Temperatura Tfin fine raffreddamento rampa Tin inizio tempo

HPLC High Pressure Liquid Chromatography in Inglese : cromatografia liquida ad alta pressione. Per aumentare il potere separatore di una colonna si può aumentare la lunghezza della colonna aumentare la superfice di contatto rendendo la polvere di supporto più fina. Quando si effettua la cromatografia su colonna in fase liquida , il liquido percola solo sotto l’azione della gravità. Se la polvere e troppo fina la gravità è insufficiente e la colonna si intasa. Si ricorre quindi a pressioni elevate che possono arrivare a 400 atm

HPLC Una tipica colonna per HPLC ha diametro di 3-:-4 mm e lungh. 10-:-20 cm Il potere separatore delle colonne per HPLC supera facilmente 20.000 piatti teorici, contro il migliaio delle colonne per gas-cromatografia lunghe alcuni metri. amplif. valvole colonna crom. filtro registr. iniettore detector pompa a siringa uscita del liquido riserva di solvente carrier

Rivelatori per HPLC RI : indice di rifrazione Spettrofotometrico UV Il liquido in uscita viene posto sul cammino ottico di un raggio Ultra Violetto in un microspettrofotometro. Quando passa una sostanza diversa dall’eluente, varia l’intensità della luce assorbita, che viene misurata da una fotocellula. RI : indice di rifrazione L’indice di rifrazione è un indicatore molto sensibile della composizione di una soluzione. Quando passa una sostanza diversa dall’eluente, varia l’indice di rifrazione.Un raggio di luce viene deviato più o meno verso una fotocellula. Rivelatore conduttometrico: Se la sostanza da rivelare è di natura ionica , allora conduce la corrente elettrica e può essere rivelata da un conduttometro.

HPLC : complessità della strumentazione L’iniettore è piuttosto complesso per evitare spruzzi di solventi ad alta pressione contro l’operatore al momento dell’introduzione del campione Il rivelatore UV può rilevare l’assorbanza solo su una fissa oppure tutto lo spettro di ogni sostanza in una frazione di secondo Il potere separatore altissimo produce diagrammi con picchi alti e stretti per la cui elaborazione è assolutamente necessario un integratore collegato ad un PC. Gli strumenti per HPLC sono quindi molto costosi e così anche i materiali di consumo Il solvente da usare deve essere di grande purezza e totalmente privo di gas Per degasare il solvente si fa gorgogliare Elio nel solvente La pompa è uno strumento di grande precisione dovendo garantire alte pressioni(20-:-200 atm) portata , programmabile costante con incrementi di 0,1 ml/min La pompa è fatta di zaffiro Alcuni strumenti hanno pompe a doppio corpo o due pompe per poter usare due solventi

Analisi qualitativa e quantitativa in HPLC L’analsi si conduce a temperatura ambiente con un solvente degassato. La presenza di bolle di gas anche microscopiche provoca dei falsi segnali. Tutte le considerazioni fatte prima per la cromatografia in fase gassosa ( tempo di ritenzione, forma e superfice del picco) sono valide anche per l’HPLC.

HPLC e composizione del solvente. Eluizione isocratica L’analisi viene condotta mantenendo costante la composizione del solvente carrier Isocratico = uguale miscela L’eluizione isocratica corrisponde in GC alla eluizione isoterma Eluizione a gradiente L’analisi viene condotta variando la composizione della miscela di solvente carrier man mano che procede l’eluizione, L’eluizione a gradiente corrisponde in GC alla eluizione a gradiente di temperatura.